摘要：目的在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体β的剪接异构体。方法针对ERβmRNA CDS序列的八个外显子,两两外显子依次组合设计引物,运用PCR法,以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织c DNA为模板扩增相应序列,测序后在NCBI网站比对,确定是目的基因后,用DNAMAN软件比对分析及手工校对,获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体,分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失300 bp),部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体(各缺失334bp,265 bp),以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失181 bp)。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列,另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体,为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。

摘要：目的研究比格犬雌激素受体β（Estrogenreceptorβ，ERβ）及其剪接异构体在生殖调控中的功能，构建比格犬ERβ的pMAL-p5x／ERβ ***重组菌株，并进行纯化和鉴定。方法Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA，RT-PCR获得cDNA，以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物，扩增ERβ保守区基因编码序列（16-496bp），连接原核表达载体pMAL-p5x，筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α，再转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，表达产物经经麦芽糖亲和树脂（AmylomResin）亲和层析分离纯化，并对纯化的融合蛋白进行鉴定。结果构建了pMAL-p5x／ERa480重组质粒，在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白，SDS-PAGE显示分子量约为60000，与预期结果一致：优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件：分别在0．2％葡萄糖，1000g／mlAmpcillin，0．1mmol／LIPTG37℃培养5h或在0．2％葡萄糖，50μg／mlAmpcillin，0．2mmol／LIPTG37℃培养3h，融合蛋白表达效果比较好。结论构建了pMAL-p5x／ERβ480原核表达重组质粒，获得了比格犬MBP—ERB融合蛋白，为犬种属特异性ERB多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础。