摘要：目的已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a/C3aR轴过度活化现象,但有关C3a/C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3a的肾小肾小管上皮细胞株,为探讨各种病理情况下C3a/C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a分泌性表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2,根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析,从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果 1成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功进行了重组慢病毒包装,得到了高滴度(5×108个/m L)的C3a表达重组慢病毒LV-C3a;3成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染,得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株;基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实,与HK2细胞比较,HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P<0.01],分泌的C3a水平显著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P<0.01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a/C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3a/C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。

摘要：目的前期的研究中发现过敏性毒素C3a受体(C3aR)在糖尿病肾病病中表达增加,但在糖尿病肾中的病理意义及其在肾组织足细胞中的生理作用尚不清楚,文中通过建立C3aR低表达的肾足细胞系(HPC-C3aRsiRNA),为研究C3aR在肾足细胞中的生理功能提供细胞模型。方法设计合成人C3aR小干扰RNA(C3aRsiRNA),将其克隆到慢病毒表达载体中,通过与包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aRsiRNA慢病毒,利用C3aRsiRNA慢病毒感染人肾足细胞HPC,根据C3aRsiRNA慢病毒具有嘌呤霉素抗性基因的特点筛选稳定转染的人肾足细胞。通过荧光定量PCR分析稳定转染的足细胞C3aR的mRNA表达水平,Western blot和免疫组化染色分析稳定转染的肾足细胞C3aR蛋白水平,鉴定稳定转染C3aR低表达的肾足细胞系。结果荧光定量PCR结果显示,与HPC-C3aRsiRNA细胞C3aR的mRNA水平(0.26±0.04)比较,非转染HPC细胞(1.00±0.13)和阴性对照(1.07±0.16)显著升高(P<0.05)。免疫组化染色显示HPC-C3aRsiRNA细胞的C3aR蛋白水平显著降低。Western blot结果显示,与HPC-C3aRsiRNA C3aR蛋白表达(0.62±0.09)比较,正常HPC、阴性转染的HPC表达(1.00±0.08、1.00±0.22)显著升高(P<0.05)。结论成功构建了C3aR低表达的肾足细胞系,可为进一步了解C3aR在肾中的生理作用提供细胞模型。

摘要：目的构建过表达C3a受体(C3aR)的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3aR表达载体和过表达C3aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。