摘要：为了分析中国北方地区现行的一株鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)SVCV-shlj4全基因组序列,根据GenBank收录的SVCV参考毒株(SVCV-A2,DQ491000.1)基因序列设计了3对重叠引物,对SVCV-shlj4毒株基因组编码区进行扩增,利用RACE试剂盒对该基因组5′和3′非编码区(Untranslated region,UTR)进行扩增,并利用DNAstar软件对测得的序列进行拼接,获得完整的SVCV-shlj4全基因组,结合Lasergene及MEGA 5.1生物信息学软件对该病毒基因组及其编码的核蛋白、糖蛋白和磷蛋白基因序列进行系统进化分析。结果表明:SVCV-shlj4毒株基因组全长为11029 bp,共编码5种结构蛋白(3′端-5′端),分别为核蛋白(Nuclear protein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA聚合酶(RNA polymerase,L);基因组序列系统进化分析显示,SVCV-shlj4毒株与中国株SVCV-A2的核苷酸序列一致性最高(99.0%),与欧洲株VR-1390核苷酸序列一致性最低(93.0%);编码M蛋白、G蛋白和P蛋白的基因序列进化分析结果显示,SVCV-shlj4毒株在进化上处于亚洲分支,属于Ⅰa基因型,Ⅰaii基因亚型;SVCV-shlj4毒株各基因变异位点分析显示,与中国株SVCV-A1相比,SVCV-shlj4毒株在N基因编码区第1357、1364和1376 nt位点分别缺失1个碱基,在G基因3′端非编码区4630 nt位点和4639 nt位点分别缺失两段基因序列(44 bp和31 bp),与欧洲株VR-1390相比,SVCV-shlj4毒株在G基因3′端非编码区(4637 nt位点)插入10 bp的基因片段,与中国株BJ0505-2相比,SVCV-shlj4毒株在L基因编码区(5822 nt位点)缺失18 bp碱基。本研究系统地分析了中国北方地区现行SVCV分离株的分子特征,为SVCV分子进化研究提供了数据支撑。

摘要：为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP 2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP 2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。

摘要：为预测鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)Shlj1株糖蛋白(Glycoprotein,G)的空间结构及B细胞抗原表位,采用RT-PCR法从接种SVCV的鲤上皮细胞悬液提取的病毒总RNA中扩增糖蛋白基因,并通过序列测定获得Shlj1株糖蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列,利用Phyre2对Shlj1分离株的糖蛋白空间结构进行预测,使用DNAStar软件综合分析糖蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数参数。结果表明:获得的SVCV Shlj1株糖蛋白核苷酸序列长1527 bp,推导出其氨基酸序列为509aa;空间结构预测显示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定数量的α-螺旋、β-折叠、β-转角及大量无规则卷曲结构,空间构象较规则;抗原指数及抗原表位指数分析显示,糖蛋白中存在许多抗原指数较高的区域,该区域平均抗原指数为1.025,最大值达1.250,其中5个区域(4~26、145~157、293~302、315~327、407~491氨基酸区段)可能是B细胞抗原表位的主要分布区域。本研究结果为SVCV糖蛋白表位疫苗的设计及单克隆抗体的制备奠定了理论基础。

摘要：在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行变性/复性后获得较纯的目的蛋白,利用ELISA和MTT方法对目的蛋白进行免疫学活性及生物学活性分析。ELISA结果显示该目的蛋白能够与商品化的抗鲑鳟鱼IGF-II的抗体发生特异性反应,并且呈现抗原浓度依赖性,该结果说明本研究获得了具有良好免疫原性的IGF-II蛋白;MTT方法测定IGF-II蛋白对鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞(epitheliaoma papulosum cyprini,EPC)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞(rainbow trout gonad,RTG-2)的增殖效果来鉴定IGF-II蛋白的生物学活性,结果显示所表达的哲罗鱼IGF-II蛋白能够有效的刺激EPC细胞和RTG-2细胞增殖。该结果表明利用原核表达系统获得的哲罗鱼IGF-II蛋白具有良好的生物学活性。本研究为哲罗鱼的生长模式和生长繁殖的研究奠定了基础。

摘要：为探究虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脂肪酸结合蛋白10(fatty acid binding protein 10,fabp10)基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能等,本试验根据Gen Bank数据库公布的河鳟(Salmo trutta)fabp10基因的CDS序列信息设计引物,通过RT-PCR获得fabp10基因片段,将目的片段与pMD-18-T载体连接转化DH5α感受态细胞,构建pMD-18-T-fabp10克隆载体,双酶切回收基因片段,构建pcDNA3.1-fabp10真核表达载体,分析fabp10基因在虹鳟不同组织中的表达,经双酶切、测序鉴定构建成功。将表达载体转染至EPC细胞,分别于24h、36 h、48 h后收集细胞进行荧光定量PCR检测。结果显示:虹鳟fabp10基因CDS区与Gen Bank数据库中Salmo trutta fabp10基因CDS区同源性高达100%。生物信息学分析发现,fabp10基因编码区全长378 bp,编码126个氨基酸。Fabp10蛋白主要分布在细胞质中,存在23个潜在磷酸化位点。转染pcDNA3.1-fabp10可显著提高EPC细胞中fabp10 m RNA的表达(P<0.05)。RT-q PCR结果显示:fabp10基因在肝脏中表达丰度最高,随之为肾脏、肌肉、肠、脾脏、心脏,在脑中表达量最低。本试验成功扩增出fabp10基因CDS区并构建了真核表达载体,成功预测分析了其结构和功能,为研究虹鳟机体脂质代谢过程提供了基础。

摘要：将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本表现为红棕色。2%琼脂糖凝胶电泳检测结果与可视化检测结果一致。该方法实现了检测结果的可视化。特异性分析显示该方法不与传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)及病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)发生交叉反应,并且可检测不低于10 pfu的IHNV RNA。本研究所建立的IHNV RT-LAMP可视化检测方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备的优点,其检测结果直观可视化,可实现现场高通量快速检测。

摘要：为了研究胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ,IGF-Ⅱ)在哲罗鲑Hucho taimen生长繁殖过程中所起的作用,根据Gen Bank收录的大西洋鲑IGF-Ⅱ基因开放阅读框序列(NCBI登录号:NM_001123647)设计用于哲罗鲑IGF-Ⅱ开放阅读框扩增的引物,以哲罗鲑肝脏总RNA反转录成的cDNA为模板,利用PCR方法克隆获得哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的长度为645 bp,编码含有214个氨基酸残基的蛋白,该蛋白的相对分子质量为24554,等电点为9.92;哲罗鲑IGF-Ⅱ前肽由信号肽、B、C、A、D、E肽6部分构成;同源性比对和系统进化分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ与鲑科鱼类IGF-Ⅱ核苷酸序列同源性最高,聚为一支,其中与大西洋鲑的IGF-Ⅱ同源性最高(98.6%),该基因在进化过程中有着高度保守的进化特性;用荧光定量PCR技术检测2龄哲罗鲑IGF-Ⅱ基因在不同组织中的表达,结果显示,该基因在肝脏中表达量最高,在心脏、鳃、脾、后肠、头肾、胃中的表达量次之,而在前肠和脑中的表达量最低。

摘要：本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。

摘要：本课题组于2012年从中国东部的虹鳟鱼养殖场分离得到了严重威胁我国鲑鳟鱼养殖的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)IHNV-Sn1203病毒株。根据GenBank中收录的IHNV病毒株的序列设计引物,将IHNV-Sn1203基因组序列分成5个片段进行RT-PCR克隆,最终得到完整的IHNV-Sn1203基因组序列。利用Lasergene和MEGA 5.0软件分析了IHNV-Sn1203株的全基因组序列、基因组编码蛋白、基因组末端和未翻译序列、以及病毒基因同源性和系统发育。结果发现,IHNV-Sn1203基因组全长11131nts,共编码6个病毒蛋白,大小分别为核蛋白(N)1176nts、磷蛋白(P)693nts、基质蛋白(M)588nts、表面糖蛋白(G)1527nts、聚合酶蛋白(L)5961nts和非结构蛋白(NV)336nts。IHNV-Sn1203株各基因间均具有保守的基因终止序列(Gene end,GE)、基因间序列(Intergenic regions,IG)、基因起始序列(Gene star,GS)及Kozak序列,以确保病毒基因的转录和翻译效率。系统进化分析发现,IHNV分为E、U、M、L和J共5个基因型,其中IHNV-Sn1203株与中国其他IHNV株具有显著的亲缘关系,属于J基因型中的J Nagano亚型。由G基因的进化分析发现,J基因型的病毒与U基因型亲缘关系最近,推测IHNV病毒最初可能通过进口鱼卵的方式由U基因型引入,随时间的推移逐渐进化为J基因型。