摘要：为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10^(2)~1×10^(7) copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.9846;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1×10^(2) copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的100倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于2%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示,PiCV阳性率达75.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%),说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测,为PiCV的及时防控提供有力技术支持。

摘要：为快速、高效构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白E基因(gE)缺失病毒,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先将pSpCas9(BB)-2A-GFP荧光质粒转染至VERO细胞和PK-15细胞,选出转染效率较高的细胞系,同时于http://***/网站设计并合成3个高评分的小导向RNA(small guide RNA,sgRNA),通过噬斑形成试验,筛选出高效sgRNA。其次将筛选出的针对PRV gE基因的sgRNA转染于PK-15细胞,然后接种PRV-1病毒,经过5轮噬斑克隆纯化获得PRV-1-ΔgE。结果显示:VERO细胞比PK-15细胞具有更好的转染效果;gE-sgRNA1和gE-sgRNA2可作为针对gE基因的高效sgRNA;获得了1株PRV gE基因缺失291 bp的病毒,将其命名为PRV-1-ΔgE。研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为一种高效编辑PRV-1缺失病毒基因的方法,同时也为后续快速应对PRV变异株研究提供了新思路。