摘要：目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因,构建其过表达和抑制表达的转基因载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过RACE和LD-PCR方法扩增全长cDNA克隆。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增UGT基因的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1 300和pHANNIBAL中。重组的pHANNIBAL经Not I酶切后插入到pART27中。最终以构建出过表达和抑制表达的转基因载体。结果:扩增到了北柴胡1个UGT基因全长cDNA克隆,构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体。结论:通过UGT基因的全长cDNA克隆和转基因载体构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。

摘要：本研究从设计多种诱导条件出发,探索建立稳定的柴胡毛状根诱导体系。发根农杆菌A4侵染北柴胡无菌苗叶基部,共培养3天后,转入抑菌培养,10天开始出现毛状根,经4～5周培养,转为液体摇培,获得大量毛状根,诱导产生的毛状根可再生成植株。毛状根再生成植株有两种方式:一种是液体摇培的毛状根自发脱落形成幼苗的继续培养,另一种是将毛状根产生脱落的类愈伤组织置于经筛选的再生固体培养基上再生成植株。柴胡毛状根及其植株再生体系的建立,为开展柴胡次生代谢研究,尤其是利用农杆菌介导的遗传转化研究和利用奠定了基础。由毛状根诱导出再生植株在新种质产生和品种改良选育方面具有应用价值。

摘要：目的研究质粒表达型shRNA对CHL-3A4转基因细胞系细胞色素P4503A4基因表达的抑制作用。方法设计并构建3条shRNA真核表达载体(CYP3A4Ⅰ、CYP3A4Ⅱ、CYP3A4Ⅲ),转染CHL-3A4转基因细胞,以空载体组及无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照;转染后48h,Westernblotting观察RNA干扰对CYP3A4蛋白表达的影响;RNA干扰后,用HPLC法测定CHL-3A4转基因细胞的硝苯地平氧化酶的活性。结果CYP3A4Ⅲ表达载体能显著抑制CYP3A4蛋白表达(75%),抑制硝苯地平氧化酶的活性。结论RNA干扰能抑制CYP3A4基因表达。

摘要：目的研究质粒表达型短发夹RNA(smallhairpinRNA,shRNA)对CHL-3A4转基因细胞的细胞色素P4503A4(cytochromeP4503A4,CYP3A4)基因表达的影响。方法设计并构建3条shRNA真核表达载体(CYP3A4Ⅰ、CYP3A4Ⅱ、CYP3A4Ⅲ),脂质体转染CHL-3A4转基因细胞。转染48h后,TR-PCR和WesternBlotting分别观察3条shRNA对CYP3A4mRNA和蛋白表达的影响;噻唑蓝(MTT)观察shRNA抑制环磷酰胺对CHL-3A4转基因细胞毒性作用。结果CYP3A4Ⅲ表达载体的shRNA分别能抑制CHL-3A4细胞的CYP3A4mRNA表达(70%)及蛋白表达(75%),抑制环磷酰胺对CHL-3A4细胞(75%)细胞毒作用。结论RNA干扰能显著抑制CYP3A4基因的表达,RNA干扰技术为肝细胞色素P450的研究提供了新的方法。

摘要：目的:建立利用简单重复序列(SSR)分子标记鉴别柴胡栽培种质的方法,初步形成可鉴别选育品系的SSR特征谱带数据。方法:从实验室先前设计的柴胡SSR引物序列中选择了50对,以2个选育品系和4份其他柴胡栽培种质为材料,筛选扩增效果好、多态性高的引物对,优化聚合酶链反应(PCR)扩增、电泳等条件,分析获得的SSR谱带,依据遗传距离构建聚类树图。结果:筛选出9对多态性高的引物,明确了检测条件,获得了试验种质的SSR特征谱带数据,在遗传相似系数为0.73处可将所有样品分为4类:黑龙江产红柴胡和川红柴1号品系聚为一类,川北柴1号品系和中柴1号品种聚为一类,四川枫顺和荣县产柴胡种质各独自聚为一类。结论:本研究筛选出的引物对和建立的检测方法可供柴胡种质鉴别参考使用。

摘要：目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶基因,构建其过量表达载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序获得5'和3'端部分cDNA序列的基础上,利用LD-PCR方法获得全长cDNA,根据全长cDNA序列设计含有酶切位点的PCR引物,利用高保真酶,以RNA反转录产物为模板PCR扩增细胞色素P450酶基因的开放读框,扩增产物与pEASY-T1 Simple载体连接,转化大肠杆菌DH5α;重组质粒pT1-P450经菌液PCR和酶切方法验证后测序,采用NCBI在线Blastx、DNAman和MEGA4软件对序列进行生物信息学分析,随后将pT1-P450的酶切产物插入双元载体pCAMBIA-SUPER 1300,菌液PCR和酶切验证重组质粒p1300-P450。结果:扩增到了北柴胡细胞色素P450酶基因BcCYP87E,构建了这一基因的过量表达载体。结论:细胞色素P450酶基因的克隆和转基因载体的构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。