摘要：目的:构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达。方法:根据人SLC和IL-2cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞。用Westernblot检测SLC和IL-2的表达。结果:Westernblot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致。结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。

摘要：目的检测人外周血单个核细胞(PBMC)与肝细胞Na+-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)基因的表达情况,探讨HBV感染PBMC的可能途径,研究乙型肝炎病毒(HBV)感染PBMC机制。方法用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,用TRIzol提取人外周血单个核细胞与肝细胞总RNA,经逆转录合成cDNA。设计合成一对针对NTCPmRNA的特异性引物,对人外周血单个核细胞及肝细胞的cDNA进行PCR扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,以检测NTCP基因在两种细胞的表达情况。结果 RT-PCR电泳显示,用NTCP基因特异性引物对肝细胞cDNA扩增,扩增产物大小在200~300bp之间,与NTCP基因理论值(246bp)相符,即肝细胞NTCP基因表达阳性;人外周血单个核细胞的cDNA扩增后进行电泳鉴定,未出现特异性条带,即NTCP基因表达阴性。结论人外周血单个核细胞不表达NTCP基因,提示其表面的HBV受体可能并非NTCP,或HBV循非受体途径进入PBMC,关于HBV感染PBMC的具体机制尚需进一步研究。

摘要：目的制备人B淋巴细胞刺激因子-白喉毒素融合蛋白(hsBAFF-DT388),探讨其靶向B细胞活性。方法根据优化合成的hsBAFF-DT388基因序列设计引物,PCR扩增目的基因并插入克隆载体pMD19-T,采用菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆,重组克隆载体经双酶切后插入表达载体pColdⅡ,并鉴定重组表达载体。重组菌株经ITPG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,经Ni2+-NTA层析柱纯化,检测重组蛋白的生物学活性。结果获得hsBAFF-DT388高效表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。重组蛋白与BAFF受体阳性细胞特异性结合并对人B细胞系***具有靶向细胞毒作用。结论成功构建hsBAFF-DT388表达载体,获得具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定基础。

摘要：为获取具有生物学活性的弓形虫 P30蛋白 ,采用定向克隆的方法 ,自行设计引物通过 PCR扩增得到 P30基因片段 ,用 Eco R 和 Sal 双酶切后 ,连接到同样双酶切的原核表达载体 (p BV2 2 0和 p MAL P2 )上 ,转化大肠杆菌 DH5 α,分别得到含重组质粒 p BV2 2 0 - P30和 p MAL P2 - P30的工程菌。扩菌提取质粒经过酶切分析和 PCR扩增鉴定后 ,证实 P30基因的两个原核表达载体构建成功 。

摘要：目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(***)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD19-T,菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆。重组克隆载体经NdeⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入表达载体pQE-T7-2的相应位点,菌落PCR鉴定重组表达载体。重组菌株经IT-PG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定重组蛋白。Ni2+-NTA层析柱纯化重组人HMGB1 A box,RT-PCR检测其对IC刺激单核细胞活化的抑制作用。结果:获得重组人HMGB1 A box的表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blot显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体特异反应。目的蛋白纯度高达90%以上,并能有效抑制IC诱导单核细胞分泌BAFF、IFN-γ及TNF-α。结论:成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效抑制IC刺激单核细胞活化后细胞因子的分泌。

摘要：克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。对GenBank上报道的hIL-26基因进行序列分析后设计合成引物,利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA中反转录并扩增得到人成熟肽IL-26基因。将得到的基因克隆到pMD18-T载体中,菌落PCR筛选、酶切鉴定并进行DNA序列分析。用BamHI和EcoRⅠ将目的片段切下,插入表达载体pBV220相应的位点。42℃热诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的20%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,分子筛纯化后纯度达90%以上。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测复性的重组蛋白能促进PBMC合成IFN-γ。

摘要：目的:运用分子生物学技术扩增CD、TK基因,进行其DNA序列分析,并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其共同转染ACC-2细胞,为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础。方法:根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物,构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析;构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞,用RT-PCR检测CD和TK的表达。结果:克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致,且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES,RT-PCR检测表明,以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK。结论:成功扩增了CD、TK的DNA片段,并进行了序列分析;成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。