摘要：参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,建立的方法与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒等不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1.0拷贝/μL,比普通RT-PCR方法灵敏10倍;组内和组间重复性试验的变异系数分别在2.2%和1.9%以下,重复性较好;应用该方法对220份临床疑似猪流感样品进行检测,荧光定量RTPCR方法和普通RT-PCR检测率分别为2.7%和1.8%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可快速检测样品中的各种SIV,从而更好地诊断和监测猪流感。

摘要：根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。

摘要：为建立一种快速、特异、灵敏检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR方法,参比NCBI中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对针对PEDV S基因的特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,建立的方法与猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒不存在交叉反应,具有较强的特异性;最低检测限度为1.0 copies/μL,比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内、批间重复性试验的变异系数分别在1.0%、2.8%以下,具有较好的重复性;对临床疑似样品进行检测,荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法总符合率为80%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好。

摘要：为了解引发贵州省某猪场腹泻疫情的猪轮状病毒(PoRV)基因组特征和遗传变异规律,本研究将鉴定为PoRV阳性的腹泻病死仔猪的肠内容物样品处理后接种Vero细胞,传代后经RT-PCR鉴定并测序,结果显示PoRV属于G5P[13]型。通过透射电镜和间接免疫荧光试验鉴定,结果显示:能观察到直径约70 nm的无囊膜的病毒粒子,接种病毒的Vero细胞有特异性的绿色荧光,表明分离获得一株PoRV,命名为GZAS2020株。根据PoRV国内外参考株序列设计11对兼并引物,经RT-PCR扩增该病毒11个节段并测序后拼接,结果显示:该病毒基因组全长18 514 bp。对GZAS2020株全基因组序列同源性分析,对其VP4、VP7氨基酸差异性及基因重组情况分析。结果显示:GZAS2020株11个节段分别与猪、人、熊猫源轮状病毒的同源性最高且遗传进化树处于同一分支,且VP7、VP4、VP6、VP1~VP3、NSP1~NSP5基因与国内外各基因型轮状病毒的同源性分别高达97.2%、95.6%、98.7%、96.3%、94.5%、96.1%、97.6%、96.5%、96.6%、98.3%、98.7%,该株病毒全基因组基因型为G5-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。GZAS2020株VP4存在23个氨基酸位点的点突变(S^(28)L、H^(42)Q、T^(133)A、A^(185)V、N^(194)S、S^(197)N、E^(200)K、I^(209)V、S^(237)P、H^(248)Q、R^(282)Q、T^(294)A、S^(361)T、Q^(362)P、I^(381)V、M^(393)V、N^(447)S、V^(455)A、T^(460)A、M^(466)I、V^(601)A、S^(655)A、S^(681)N),VP7存在20个氨基酸位点的点突变(C^(44)R、Y^(68)H、F^(86)L、I^(105)V、S^(110)P、D^(116)Y、V^(137)I、R^(154)G、T^(158)I、M^(168)V、F^(175)V、C^(203)Y、S^(221)G、R^(232)C、P^(238)S、C^(262)S、S^(266)R、S^(278)P、T^(282)A、M^(295)V)。重组分析结果显示,GZAS2020株VP4基因和NSP4基因存在重组事件,是由KT727244.1株和MK227934.1株的VP4基因、MK228074.1株和AF144797.1株的NSP4基因重组形成的重组病毒。综上所述,GZAS2020株是由猪源病毒株重组而来,存在跨种间传播,且有传播给人的风险,应引起高度重视。本研究在贵州首次分离到G5P[13]型PoRV,对其遗传演化特征分析为PoRV感染的防控提供参考依据。