摘要：目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体，转染293T细胞，建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点，使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列，对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体，构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后，将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞，荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果，重组质粒pGC-Fu-Shh的测序，Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜，24h后观察到绿色荧光蛋白的表达，基本判断Shh表达，说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品，可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合，判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因，将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中，并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体，获得了稳定转染的细胞株。