摘要：目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,观察其与姜黄素单独或联合对结肠癌SW480细胞凋亡及周期分布的影响。方法设计VP3 cDNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3 DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP连接构建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒,PCR和EcoRⅤ酶切电泳鉴定;线性化穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,构建pAd-VP3重组腺病毒质粒并经PCR、电泳及测序鉴定,线性化腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞进行pAd-VP3重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其单独或联合姜黄素作用人结肠癌SW480细胞,观察其对细胞凋亡及周期分布的影响。结果pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒构建鉴定成功,pAd-VP3重组腺病毒质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出了402 bp的片段,重组质粒测序证实VP3-hrGFP编码区成功地克隆入了腺病毒pAd中,且其序列与GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu·ml-1,获得的重组腺病毒及姜黄素单独或合用均可阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),二药联用效果更为显著(P<0.01)。结论细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并能与姜黄素协同通过阻滞细胞周期于G0/G1期诱导结肠癌SW480细胞凋亡。

摘要：目的探讨槲皮素对人宫颈癌He La细胞株的放射增敏作用及槲皮素放射增敏作用机理。方法克隆形成法研究不同浓度槲皮素(20%IC_(50)和IC_(50))及不同给药时序(先放后药和先药后放)对宫颈癌He La细胞的放射增敏作用,根据实验设计分为单放组、20%IC_(50)槲皮素先药后放组、20%IC_(50)槲皮素先放后药组、IC_(50)槲皮素先药后放组、IC_(50)槲皮素先放后药组,检测各组经不同量X线照射(12、8、6、4、2、0 Gy)后的细胞存活率(SF)。选择上述实验结果最佳给药时序,将实验设计为未加药对照组、单放组、单药1组(20%IC_(50))、单药2组(IC_(50))、药放1组(20%IC_(50))及药放2组(IC_(50)),放疗剂量为4Gy,分别采用流式细胞法、DAPI染色、Western blotting(仅采用20%IC_(50))检测各组处理24 h后的细胞周期分布、细胞凋亡变化及Bcl-2、Bax蛋白水平。结果不同浓度槲皮素及不同剂量射线按不同时序处理后的各组细胞与单放组比较SF均下降(P<0.05)。SF与槲皮素浓度呈反比,药物浓度越高,槲皮素的放射增敏作用越强。相同浓度药物和相同剂量射线不同处理时序相比较,先放后药组的SF均比先药后放组低。DAPI染色后荧光显微镜显示,放射线及槲皮素均可引起He La细胞核不同程度的皱缩,两者联合作用后胞核皱缩、碎裂更为明显。流式细胞仪检测显示,与其他各组比较,药放联合组G2/M期阻滞更显著(P<0.05)。Western blotting检测显示,药放联合组Bcl-2蛋白表达下调较其他各组更加显著(P<0.05),但Bax蛋白表达上调与槲皮素单药组比较差异无统计学意义。结论槲皮素对He La细胞具有放射增敏作用,其增敏作用具有浓度及时序效应;放疗增敏作用的机制可能与诱导细胞凋亡、阻滞细胞于G2/M期及下调Bcl-2/Bax比例有关。

摘要：[目的]利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其体外诱导结肠癌细胞凋亡的作用。[方法]设计VP3 c DNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序列,与线性p Shuttle-IRES-hr GFP连接构建p Shuttle-VP3-hr GFP重组穿梭质粒,PCR和Eco RⅤ酶切电泳鉴定;重组穿梭质粒经Pmel酶切线性化后,转化含p Adeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒p Ad-VP3-hr GFP,PCR、Pac I酶切电泳及测序鉴定;线性化重组腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞进行p Ad-VP3-hr GFP重组腺病毒的包装和扩增,Cs CI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其作用人结肠癌SW480细胞,观察其对细胞凋亡及周期分布的影响。[结果]p Shuttle-VP3-hr GFP重组穿梭质粒构建成功;p Ad-VP3-hr GFP重组腺病毒质粒经酶切获得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出402bp的片段,测序证实VP3-hr GFP编码区成功克隆入腺病毒p Ad中,且其序列与Gene Bank中VP3序列完全一致;成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu/ml,重组腺病毒可阻滞结肠癌细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,MOI值越大作用效应越显著(P<0.05,P<0.01)。[结论]细菌内同源重组法可快速、高效制备携带凋亡素基因的重组腺病毒,并具有较强的抗肿瘤作用,为深入研究VP3基因功能提供了选择。