摘要：目的:探讨针对乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS1 dsDNA同聚嘌呤区设计反基因锁核酸分子,并观察其在HepG2 2.2.15细胞内抑制病毒复制的效果.方法:针对HBVpreS1 dsDNA的2941-2962 nt、3 015-3 036 nt和3 089-3 110 nt三个同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG22.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)和时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)分别监测1、3、5和7 d细胞培养上清液中HBV DNA和HBsAg的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:反基因锁核酸对细胞内的HBV DNA复制与HBsAg表达有明显的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7 d后抑制率分别为64.32%和67.51%.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05),而封闭2 941-2 962 nt同聚嘌呤靶区的LNA抑制作用最强,且最适序列长度为20-30 ***对细胞代谢无明显影响.结论:针对preS1 dsDNA同聚嘌呤区的反基因锁核酸分子,体外能有效抑制HBV的复制,以封闭2 941-2 962 nt靶位效果最强,且合适序列长度为20-30 bp.

摘要：为探讨针对前C/C双靶区反义锁核酸(LNA)对转基因小鼠体内乙肝病毒复制的影响,本文采用完全随机设计分组,经尾静脉给药,实验组注射脂质体包裹的反义LNA片段,对照组分别注射5%葡萄糖液和空脂质体,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术、时间分辨免疫荧光技术、自动生化分析仪等分别检测血清乙肝病毒核酸、乙肝病毒表面抗原、清蛋白、谷丙转氨酶、尿素氮和肌酐等指标浓度;采用免疫组化法检测肝细胞内乙肝病毒核心抗原分布。结果表明,针对前C/C双靶区的反义LNA对乙肝病毒核酸复制、乙肝病毒表面抗原及核心抗原合成均有较强的抑制作用,且抑制效果明显高于单靶区。

摘要：目的:观察针对丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(NCR)内源性核糖体进入位点(IRES)的锁核酸核酶对HepG2.9706细胞中HCVRNA表达的抑制作用.方法:设计合成针对HCV5'-NCR区IRES位点的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme.实验设对照组与实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组、无关DNAzyme对照组、裸DNAzyme对照组.实验组包括脂质体-DNAzyme组、脂质体-硫代修饰DNAzyme组、脂质体-LNAzyme组.观察用药后1、3、5、7d时,对HepG2.9706细胞的HCVRNA及荧光素酶基因表达的抑制效应.结果:脂质体包裹的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme对HCVRNA表达均有抑制作用,平均抑制率分别为28.10%、35.25%和44.58%.对荧光素酶基因表达也有抑制作用,平均抑制率分别为31.18%、40.69%和52.33%.与对照组比较均有显著性差异(P<0.05).对HepG2.9706细胞未见明显细胞毒性作用.结论:LNAzyme对HepG2.9706细胞内HCVRNA的表达具有显著抑制作用,且优于硫代修饰的DNAzyme,是一类特异的高效抗HCV分子药物.

摘要：目的探讨针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用。方法针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S1抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S1抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7 d后抑制率分别达65.99%、67.49%和63.88%。LNA对细胞代谢无明显影响。结论针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据。

摘要：目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因翻译起始区反义锁核酸(LNA)片段在HepG22.2.15细胞内抗病毒效果及有效LNA序列筛选.方法:设计合成互补于HBVS基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞,采用ELISA法和FQ-PCR法分别监测24、48和72h细胞培养上清液中HBsAg和HBVDNA的含量;MTT法检测LNA对细胞代谢的影响.结果:4条不同序列长度(10、15、20及25个碱基)的反义LNA对HBsAg的表达和HBVDNA的复制均有显著性抑制作用,72h后的抑制率分别为46.58%、54.38%、72.43%、69.92%及27.09%、28.77%、34.71%、32.68%,且抑制率随时间呈增高趋势.LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对HBVS基因mRNA翻译起始区的反义LNA短序列体外能显著抑制HBV基因的表达,且抑制作用最强的序列长度应在15-25个碱基之间.

摘要：目的探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸(LNA)片段在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果及有效LNA片段筛选。方法设计合成互补于HBVS基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)分别监测24、48和72 h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢。结果4条不同序列长度反义LNA均显著抑制HBsAg表达和HBVDNA复制,72 h后最高抑制率分别达72.43%和34.73%。HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组(P<0.01)。LNA对细胞代谢无明显影响。结论针对HBVS基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用最强序列长度在15～25个碱基之间。

摘要：目的:探讨针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)C基因的锁核酸核酶对病毒RNA复制与表达的特异性抑制作用.方法:设计合成能切割HCV C基因位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme.实验设对照组和实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组和脂质体-无关LNAzyme对照组.实验组包括脂质体-DNAzyme、脂质体-硫代DNAzyme组和脂质体-LNAzyme组.以阳离子脂质体介导转染hepG2.9706细胞.采用荧光定量PCR和化学发光技术分别监测24、48、96 h细胞培养上清液中HCV RNA含量及荧光素酶基因表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢.结果:加入药物后,脱氧核酶、硫代脱氧核酶及锁核酸核酶组对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达的抑制作用均较对照组强(P<0.01),其中,锁核酸核酶的抑制作用均较脱氧核酶及硫代脱氧核酶明显(P<0.05),平均抑制率分别达47.55%和52.44%,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,96 h后,HCV RNA复制和荧光蛋白表达的下降率均较用药前明显(P<0.01),其中,锁核酸核酶的抑制作用均较脱氧核酶及硫代脱氧核酶明显(P<0.05),平均下降率分别达79.40%和80.05%.而LNAzyme对细胞活性基本无影响.结论:LNAzyme能特异性抑制HCV C基因的复制与表达,且优于硫代修饰的DNAzyme.

摘要：目的探讨针对丙肝病毒5'非编码区内源性核糖体进入位点的锁核酸核酶(LNAzyme)对病毒基因复制与表达的特异性抑制作用。方法设计合成能切割HCV-5'-NCR-IRES位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme。实验设对照组和实验组。对照组包括空白对照组、脂质体对照组和无关LNAzyme对照组。实验组包括DNAzyme、硫代DNAzyme组和LNAzyme组。以阳离子脂质体介导转染hep G2.9706细胞,用荧光定量PCR和化学发光技术分别监测24、48和96 h细胞培养上清液中HCV RNA含量及荧光素酶基因表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞活性。结果加入核酶后,LNAzyme对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达的抑制作用最强(P<0.05),平均抑制率分别为48.02%和53.05%,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,96 h后,平均抑制率分别为81.21%和84.25%。LNAzyme对细胞活性无影响。结论 LNAzyme能特异性抑制丙型肝炎病毒5'非编码区的基因调控,且优于硫代修饰的DNAzyme。

摘要：目的探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据。

摘要：目的探讨针对乙型肝炎病毒（HBV）S编码链的反基因锁核酸在转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法将30只HBV转基因小鼠随机分为5组（力=6），分别为空白（5％葡萄糖＋脂质体）对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义锁核酸对照组、反基因锁核酸组。拉米夫定组用灌胃法，锁核酸经尾静脉注入小鼠体内。采用实时荧光定量PCR检测血清HBVDNA；酶联免疫法检测血清HBV表面抗原（HBsAg）i逆转录PCR检测肝脏HBVSmRNA水平；免疫组织化学方法检测肝细胞HBsAg水平。组间比较用单因素方差分析。结果治疗后的3、5、7d，反基因锁核酸对HBVDNA抑制率分别为37．18％、50．27％、61．46％，HBsAg抑制率分别为30．17％、44．00％、57．76％，与给药前比较差异有统计学意义（p〈0．01）。HBVS基因mRNA的相对表达量为0．33、肝细胞HBsAg阳性细胞率为31％，与对照组比较，差异有统计学意义（p〈0．05）；肝肾生物化学指标检查和组织HE染色未发现异常改变。结论针对HBVS编码链设计的反基因锁核酸在转基因小鼠体内具有较好的抗病毒效果，为HBV的基因治疗提供理论依据和实验基础。