摘要：【目的】试验旨在探究线粒体融合蛋白2(MFN2)基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。【方法】利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列(siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275)和1条阴性干扰序列(siMFN2-Negative);利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数∶细胞个数=100∶1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(BAX)的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低(P<0.01),pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加(P<0.01),成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组(P<0.05),BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组(P<0.01);布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.05),细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.01)。【结论】本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。

摘要：为了筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白的多表位亚单位疫苗,本研究选用4种B细胞预测软件(immunomedicine group、ABCpred、BepiPred、SMVTriP)和2种T细胞预测软件(NetBoLApan、NetMHCIIpan)筛选出重叠肽作为优势表位,通过柔性linker连接成多表位疫苗,使用免疫信息学方法对抗原性、过敏源、理化性质、糖基化位点、二级和三级结构进行评估。通过二硫化物工程提高疫苗稳定性。使用分子对接评估疫苗构建体与免疫受体的结合能力,最后进行silico克隆。结果表明,成功构建17000相对分子质量的可溶性蛋白质,免疫信息学结果表明,疫苗构建体是非过敏性良好抗原,具有一个潜在的N-糖基化位点,在二级结构中α螺旋占约3.2%,β折叠占约43.2%,无规卷曲占约53.6%。三级结构Ramachandran作图发现优势区域中含有88.2%残基,进行细化后优势区域的残基增加到93.5%,3D模型表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,二硫化物工程确定出3对残留物可以形成二硫键,分子对接表明疫苗构建体与TLR3受体具有高亲和力,最后密码子优化和silico克隆确保设计的亚单位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中更高表达。免疫信息学分析表明这种多表位疫苗可以有效表达并能够诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为BVDV E2多表位疫苗的设计提供了一种新的方法。

摘要：利用生物信息学方法分析牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E^rns蛋白,筛选出优势B淋巴细胞(简称B细胞)和T淋巴细胞(简称T细胞)表位组装成多表位蛋白,并在大肠埃希菌中进行表达和验证。首先从NCBI GenBank数据库获得E^rns蛋白的氨基酸序列,将所得到的序列进行理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化、酰基化位点分析,预测二级结构及二硫键的位置,使用4种B细胞和2种T细胞软件预测其抗原表位,将预测的表位进行筛选并组装成多表位疫苗,进行密码子优化确保其在大肠埃希菌中高效表达,最后进行蛋白的纯化和Western blot验证。结果显示,E^rns蛋白由227个氨基酸残基组成,分子质量约为26 ku,理论等电点8.62,化学式为C1131H1768N326O335S14,不稳定系数为29.98,亲水性平均值(GRAVY)和脂肪指数分别-0.529和71.37,在大肠埃希菌体内半衰期大于10 h,不具有跨膜结构域,主要定位在细胞质中,有21个翻译后修饰(PTM)位点;在E^rns蛋白的二级结构中,α螺旋占约36.12%,β折叠占约18.06%,β转角占约7.93%,无规卷曲占约37.89%,而且具有4个二硫键。将筛选出的5个B细胞和6个T细胞优势表位用柔性linker组装成多表位疫苗,Western blot结果显示多表位蛋白对BVDV阳性血清具有良好的反应原性,为牛病毒性腹泻病毒E^rns多表位蛋白后续的研究奠定了基础。

摘要：为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低(P<0.01),过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高(P<0.01),成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少(P<0.01),抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01),促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高(P<0.01)。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低(P<0.05),IFN-γ水平极显著降低(P<0.01),SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。