摘要：目的定点突变是通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的 DNA片段中引入包括碱基的添加、删除、点突变等所需变化。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段。连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心脏表达最丰富的连接蛋白,主要分布在心室,其构成的缝隙连接(gapjunction,GJ)在心肌细胞中的电偶联中起着非常重要的作用。近年来的研究表明干细胞移植治疗心肌梗死时,细胞间电偶联障碍是导致心律失常副作用的一个重要原因。己知Cx43的磷酸化状态可以调节通道的功能,磷酸化常见的是368位点的丝氨酸磷酸化。我们对缝隙连接蛋白43基因(Cx43)的特定碱基进行定点改变,从而改变对应的氨基酸序列,并对表达产物进行研究,以利于将来探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染突变的Cx43对其向心肌分化能力的影响,及其磷酸化状态是否对心律失常有调控作用。方法设计引物,sense:5'-CTTCAAGCAGAGCCAGCAGTCGTGCCAGCA-3',antisense:5'TGCTGGCACGACGACTGCTGGCTCTGCTTGAAG-3'。以已构建的Pcdh-Cx43为模板,使用Stratagene基因定点突变试剂盒进行PCR扩增,用DpnI酶识别甲基化位点并将其酶切,PCR产物转化后筛选阳性克隆,提取质粒测序验证。在293FT中与其它3个穿梭质粒一起包装,再将慢病毒颗粒转染BMSCs,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆BMSCs-mCx43,在压力培养基下传代培养。用流式细胞仪检测BMSCs-mCx43的干细胞相关表面标记表达情况,同时用western blot检测BMSCs-mCx43的蛋白表达情况。结果测序结果显示突变位点正确,荧光照片显示90%的293FT表达绿色荧光。50%的BMSCs有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞仪检测示BMSCs-mCx43细胞CD29阳性表达94%±0.8%,CD73阳性表达92%±0.7%,几乎不表达CD34和CD105,与未转染病毒的BMSCs和转染空病毒载体的BMSCs的表面标记一致。Western blot结果显示BMSCs-mCx43中的mCx43表达强于未转染病毒的BMSCs和转染空病毒载体的BM-SCs。结论本实验研究表明使用定点突变法能成功将Cx43的368位点的丝氨酸突变成丙氨酸。用慢病毒载体转染BMSCs,能使BMSCs稳定持久表达mCx43蛋白,且转染慢病毒,不改变BMSCs的分子表面标记,是对BMSCs进行基因修饰的一种有效方法。

摘要：目的明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)表达的转录因子。方法构建长度依次递减的MIF基因5’调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化入人脐静脉内皮细胞EAhy926。利用双荧光基因报告系统检测AngⅡ诱导后MIF基因5’调控区不同区段的转录活性。通过突变转录活性高的MIF5’调控区序列,初步确定可能的转录因子结合序列。设计针对可能的转录因子的小干扰RNA(siRNA)序列,并构建其表达载体,分别检测候选转录因子沉默的HEAY926中MIF的转录活性和表达水平。结果双荧光基因报告检测显示,AngⅡ调控MIF表达的高转录活性区段位于-507至-188之间。序列突变和荧光素酶活性分析显示,MIF基因5’调控区-350至-339间的AP-1结合序列决定了MIF基因的转录活性。AP-1沉默后的HEAY926中AngⅡ调控的MIF转录活性显著降低(P<0.05),MIFmRNA和蛋白的表达水平也显著降低(P<0.05)。结论AngⅡ通过转录因子AP-1调控内皮细胞中MIF的表达。

摘要：目的建立Ⅱ型糖尿病合并高血压大鼠模型,评价动物心功能情况并测定模型大鼠心肌细胞钙瞬变特征。方法 STZ20 mg/kg一次性尾静脉推注后用自行设计配制的高脂饲料喂养SD大鼠,并给予0.02%L-Name溶液作为日常饮水,期间监测处理前后大鼠空腹血糖(FPG)、OGTT2h血糖(PG2h)及尾静脉血压。12周后麻醉大鼠,Mmode超声心动图测定心功能各项指标。完毕处死大鼠,分离心肌细胞用Fluo-4AM荧光指示剂负载后60HZ电刺激记录钙瞬变变化。结果 (1)饲喂12周后,模型组大鼠FPG>7.0 mmol/L(p,PG2h>11.1 mmol/L(P140 mm Hg并显著高于对照组;(2)超声心动图监测分析结果:模型组左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)升高,左室后壁舒张末期厚度(LVPWd),左室射血分数(EF)及左室收缩百分率(EFS)下降(P<0.05);(3)电刺激后模型组心肌细胞钙瞬变达峰时程和半数衰减时程均显著长于对照组(P<0.05)。