摘要：背景:实验前期项目已协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型,并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析。但在气管干细胞的增殖分化过程中,究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚。目的:利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤,检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成。材料:清洁级2周龄Wistar大鼠18只,用于制备离体气管环。氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产。方法:将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组:损伤组将气管环置于含12.5mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中,作用12h后去除氟尿嘧啶,换成新鲜的HamsF-12液继续培养,分别于3,6,12,24,48h取部分等量组织块。对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶,其余培养条件及取材时间同损伤组。主要观察指标:RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化。结果:氟尿嘧啶作用12h后,光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上,前期实验已证明其为气管干细胞。RT-PCR结果显示,对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达,β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达。损伤组经氟尿嘧啶作用后,可检测到Wnt-1 mRNA的表达,β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降;Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3,6,12h达到高峰;24h后三者mRNA表达水平均下调;至48hWnt-1 mRNA无表达,后三者mRNA少量表达。结论:在整个气管上皮重建过程中,Wnt1、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律,提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控。

摘要：背景:干细胞和细胞外基质的互相作用需要Wnt信号途径的参与。在气管损伤后的修复过程中,不同的分子信号级联控制干细胞的迁移、增生与分化,Wnt信号途径是否参与其中?目的:检测并验证Wnt/β-Catenin信号途径在气管干细胞增殖分化中的作用。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2004-05/2006-07在沈阳医学院完成。材料:2周龄Wistar大鼠,雌雄不拘,作为离体气管来源。方法:实验组以含氟尿嘧啶的HamsF12培养液作用离体大鼠气管,作用12h后换成单纯Hams F12液,对照组只用Hams F12液培养。主要观察指标:去除氟尿嘧啶后于0,6,12,24,48h采用免疫组织化学SP染色及蛋白印迹法检测气管上皮中Wnt-1和β-Catenin的表达。结果:氟尿嘧啶作用12h后,大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,暴露出基底膜,仅剩余少数较分散的间隔分布的近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上。氟尿嘧啶去除6h后,气管基底膜上可见少量扁平样细胞。24h后基底膜上细胞数目增加,并逐渐分化呈立方状,连接成片。48h后气管上皮中出现假复层柱状上皮,并可见纤毛细胞。免疫组织化学及蛋白定量结果显示:正常及损伤后0h气管上皮极少量表达Wnt-1及β-Catenin,损伤后6hWnt-1及β-Catenin表达最强,其后随时间延长,表达逐渐减少。结论:Wnt-1时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合,胞浆中游离状态的β-Catenin表达可能产生了促进气管干细胞的增殖并抑制其分化的作用。