摘要：【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10^(8)TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。

摘要：开放式实验教学模式是针对传统实验教学模式的弊端提出的,结合教学体验,探讨开放式实验教学实验项目的选取、实验内容的设计、实验方法的确定、实验实施的过程、考评体系的创新等,从而进一步提高学生的实验综合能力。