摘要：为了对禽腺病毒4型(FAdV-4)引发的鸡心包积水-肝炎综合征的病原学监测和疫情诊断提供技术支撑,本研究经对部分发表在NCBI的禽腺病毒4型序列进行比对,在其六邻体基因上找到一段相对保守序列,并设计出PCR引物和TaqMan探针。以FAdV-4 HB1510株作为标准品,通过反应条件优化,建立了FAdV-4荧光定量PCR检测方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了分析。结果显示,该方法的灵敏度为10 EID_(50)/mL,为常规PCR方法的10倍;组内和组间重复性良好;与鸡减蛋综合征病毒、大肠杆菌等禽类病原的核酸无交叉反应。通过对65份临床样品进行检测,FAdV-4荧光定量PCR和常规PCR的检测符合率为90.7%。因此,FAdV-4荧光定量PCR的快速、敏感、特异等优点使其在禽腺病毒4型的早期检测及预防、控制等方面有较好的应用前景。

摘要：为了建立新城疫疫苗株Mukteswar株的反向遗传操作系统,根据Mukteswar株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过Overlap PCR和In-Fusion无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至pACNR-T7中,获得了Mukteswar株全长cDNA克隆质粒pAC-Mukteswar。将其和3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染至预先感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞,成功拯救出重组病毒rMukteswar。对rMukteswar的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MDT)等生物学特性进行测定,结果显示rMukteswar具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株Mukteswar的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。

摘要：根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测鸭黄病毒的方法。结果表明,该方法具有很好的特异性和重复性,荧光定量PCR敏感性是常规PCR的100倍左右。同时对30枚人工接种的鸭胚进行检测并与常规PCR方法进行比较,检测结果也表明荧光定量PCR法比常规PCR的敏感性高。

摘要：选择禽流感病毒NP基因 ,设计并合成一对外引物和一对内引物 ,建立并优化了检测禽流感病毒核酸的逆转录套式PCR法 ,通过实验室检测结果证明 ,该方法具有高度的特异性和敏感性 ,能够用于检测所有的禽流感病毒核酸 ,最低能检测出 0 2pg的AIVRNA ;临床应用结果表明 ,该方法能够应用于规模化鸡场进行禽流感病毒检测 。

摘要：本试验从湖北省分离到3株J亚群禽白血病病毒,并通过病理解剖、DF-1细胞培养和RT-PCR进行了鉴定,分别命名为HB1002、HB1003和HB1009。根据J亚群原型毒株HPRS-103序列设计引物,扩增gp85基因并测序。序列分析表明：基因片段大小均为921 bp,与预期一致;分离到的3株病毒之间核苷酸同源性在97.7%~99.7%,氨基酸同源性在95.1%~99.0%;与原型毒株HPRS-103核苷酸序列同源性在94.1%~94.8%;与其它ALV-J核苷酸同源性在87.6%~97.3%;进化树分析表明,分离到的3个毒株与JS09GY6同源性最近,在95.2%~97.3%。

摘要：为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析表明,重组蛋白gp85具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,该方法对其它相关的禽类病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均低于13%,具有良好的重复性。对458份临床血清样品进行检测,同时用IDEXX的同类ELISA抗体检测试剂盒进行对比,总符合率达到96.29%。本研究为ALV-J的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

摘要：经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对，在其F基因上找到1段相对保守序列，根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针，以新城疫I系疫苗株（Mukteswar株）作为标准品，通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验，建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为10^2.2ELD50／mL，且在10^8.2～10^2.2ELD50／mL内Ct值与病毒浓度的对数值（1gELD50／mL）呈很好的线性关系，R^2达到0．9975；该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应；批间和批内重复性良好；临床样品检测中荧光RT—PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98．5％，50．0％和98．4％。因此，荧光RT—PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法，为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础。

摘要：为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序列的克隆载体作为标准品,进行系列条件优化及特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明:该方法具有很好的特异性和重复性,外毒素cpa的灵敏度为1.5×10^(-2)ng/m L,且在1.5×104~1.5×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.991;肠毒素cpe的灵敏度为1.8×10^(-2)ng/m L,且在1.8×103~1.8×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.996;该方法对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌核苷酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;同时对实验室保存的临床分离的疑似菌株用建立的荧光定量方法进行检测,结果临床分离菌株均为A型产气荚膜梭菌。说明该双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强和重复性好。

摘要：细胞核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)普遍存在于真核细胞内,在天然免疫、炎症、代谢等方面起着重要作用。为获得番鸭NF-κB的nf-kb1和nf-kb2亚基序列,试验设计引物对这两个亚基进行了克隆、序列鉴定及进化分析。

摘要：参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析。结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt;同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中。说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性。