摘要：为建立一种快速、灵敏且适用于现场即时检验(POCT)锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法,本研究根据KHVTK基因的保守序列,遵循荧光RAA引物及探针设计原则,设计多套KHV特异性引物及1条探针,通过试验筛选出最佳引物对,建立了KHV的重组酶介导等温扩增(RAA)荧光检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性及临床样本测试。结果显示,本方法最低检测限为7.01×10^(2) copies/μL,与WOAH推荐的TK基因PCR检测方法一致(同为7.01×10^(2) copies/μL),高于Sph基因PCR检测方法(7.01×10^(3) copies/μL),低于KHV real-time PCR检测方法(7.01×10^(1) copies/μL)。RAA荧光方法特异性良好,与鲤春病毒血症病毒(SVCV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、金鱼造血器官坏死病毒(CyHV-2)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)均无交叉反应,临床样本检测结果与WOAH推荐的两种检测方法结果一致,且仅需20 min。结果表明,锦鲤疱疹病毒RAA荧光检测方法具有简单快捷、敏感性高、特异性好等优点,可为实验室条件有限的养殖场及海关监管现场的快速病原筛查提供有效的技术手段,满足生产一线的疫病监测需求。

摘要：为有效鉴定熊科(Ursidae)物种,根据熊科动物线粒体细胞色素c氧化酶2(cytochrome c oxidase subunit 2,COX2)基因设计扩增片段为790 bp的通用引物,对9份熊科动物组织样本、4份熊科动物合成质粒和16份对照样本进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增、电泳和测序,计算物种遗传距离,并采用邻接法构建进化树。结果显示:16份对照样本均未见扩增条带;9份熊科动物组织DNA和4份熊科动物合成质粒的检测结果符合预期,且与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)参考序列的一致性均>96%;8种熊科动物的最大种内遗传距离为0.014%,最小种间遗传距离为0.022%,存在显著条形码差距。结果表明,本研究所建立的COX2基因DNA条形码方法能够准确鉴定熊科物种,可为海关等执法部门打击违法犯罪行为、履行《濒危野生动植物种国际贸易公约》提供技术支撑。

摘要：为了对掺入猪肉成分的比例进行鉴定,本研究拟建立基于同源加尾系统(Homo-tag Assisted Non-dimer system,HANDS)的双重实时PCR检测方法,借助简易数学模型将实时PCR的Ct值(循环阈值)换算成猪肉成分的百分比。根据常见家畜、家禽染色体中的管家基因Myostatin序列设计家禽家畜通用引物和探针序列,针对猪染色体beta actin基因设计猪源性成分特异型引物和探针序列,并在所有引物5’端加上同源引物。通过评估以上两套引物和探针的通用性,特异性,优化引物和探针浓度、退火温度,构建同源加尾双重实时PCR检测方法对不同猪源性成分比例的肉样进行检测并换算Ct值得出混合肉样中猪源性成分的比例。所构建的同源加尾双重实时PCR方法两重之间扩增效率相近,通用性引物、探针可以扩增所有家畜家禽成分,特异性引物探针只扩增猪源性成分。通过检测制备的混合肉样显示,该方法换算结果与肉样实际比例接近。

摘要：为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。

摘要：为了对犀牛源性成分进行有效鉴定,根据犀科(Rhinocerotidae)动物线粒体DNA(mitochondrial DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测犀牛源性成分的方法。结果显示,建立的PCR方法可以对犀牛阳性样品进行扩增,凝胶电泳呈现特异性条带。方法特异性好,13份其他物种的样品均为阴性结果。方法灵敏度较高,可检测到100拷贝重组质粒DNA模板。对5份送检样品检测发现2份犀牛样品,与测序结果一致。结果表明,新建立的方法可应用于样品中犀牛源性成分的检测。

摘要：建立了可同时筛选禽流感病毒(AIV)通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及鸡新城疫病毒(NDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因芯片检测方法。从GenBank中下载相关序列,利用分子生物学软件设计特异性引物和杂交探针。使用***系统进行芯片点样、杂交、显色、读数,优化反应条件后做灵敏度、特异性试验,然后应用于临床检验。结果显示,各病原间无交叉反应,探针可特异性识别靶基因;病原的最低浓度为4.83pg/μL,灵敏度较高;每个梯度的两个反应结果一致,重复性良好。对临床样品检验,结果同病毒分离鉴定方法一致。本研究建立的基因芯片检测方法可用于禽流感通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及NDV、EDSV的鉴别检测。

摘要：为有效鉴定高鼻羚羊(Saiga tatarica)源性成分,基于细胞色素c氧化酶亚型Ⅰ基因设计特异性引物对高鼻羚羊角、高鼻羚羊角粉,以及与其种属相近或形态学相似的动物角和动物组织的DNA进行PCR扩增,对扩增产物进行桑格测序和序列分析,并对高鼻羚羊的物种分类问题进行探讨。结果表明:所有对照样品均未见扩增条带,阳性样品与NCBI基因数据库参考序列的相似性均大于99.42%,说明桑格测序法能准确鉴定高鼻羚羊成分,但由于证据不足,无法明确该方法能否进一步区分高鼻羚羊与蒙古高鼻羚羊(***)。

摘要：本研究利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),以狂犬病病毒的核蛋白基因保守区段设计LAMP引物,建立了狂犬病病毒的RT-LAMP快速检测方法,并对建立的方法进行了特异性、灵敏度和稳定性试验。结果显示,该方法检测结果可直接用肉眼判断,重复性好,稳定可靠,可将狂犬病病毒与犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒(PIV)、犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)进行鉴别,对86份犬唾液样品和3种商品化狂犬病疫苗进行检测表明,建立的方法适用于样品中狂犬病病毒的临床检测。

摘要：2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。

摘要：根据Gen Bank数据库中禽白血病病毒（ALV）K亚群特异性的gp85基因序列,设计了特异性检测ALV K亚群（ALV-K）的RT-LAMP引物。对内、外引物浓度组合和反应温度进行优化,建立了ALV-K的RT-LAMP检测方法。特异性试验结果显示,本方法只对ALV-K进行特异性扩增,而对禽白血病的其他亚群以及NDV、REV、AIV、MDV、IBV等常见禽病病原未见扩增。敏感性试验表明,本方法最低能够检测到3.4×104copies/L的质粒。