摘要：阿司匹林的抗血小板作用在临床存在显著的个体差异,而rs5918、rs12041331和rs730012 3个单核苷酸多态性位点与阿司匹林的药效和不良反应有着密切的联系。本文基于PCR结合焦磷酸测序技术,建立了阿司匹林相关SNP位点的基因分型方法。自主设计扩增引物和测序引物;优化PCR扩增条件,使3个位点能够在相同的条件下扩增并通过梯度稀释基因组DNA检测方法的灵敏度;最后,分别基于本文建立的新方法和Sanger测序技术对20例临床样本进行3个位点的基因分型,验证该方法的准确性。结果显示,本文成功建立了阿司匹林个体化用药相关SNP位点的基因分型方法,检测下限低至0.4 ng基因组DNA,用两种方法对20例临床样本进行3个位点的基因分型,结果完全一致,说明该方法有较高的准确性。

摘要：目的:建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法:首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果:成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌:副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论:本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。

摘要：目的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的传统检测方法因操作繁琐等因素,不适于现场快速检测。以乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测为例,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的HBV核酸等温扩增检测方法并设计了配套的RPA产物可视化检测装置。方法首先设计了可用手机拍照采集图像并经肉眼可视化判读检测结果的RPA产物检测装置;然后根据HBV基因保守序列设计RPA引物及探针,通过监测RPA反应的实时荧光曲线来比较各引物对的扩增效率来筛选最佳引物对并优化最适的反应条件,采用人工合成的HBV靶标质粒考察可视化检测的灵敏度,并通过检测人工合成的包含丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、流感病毒、人乳头瘤病毒核酸片段的质粒来考察了方法的特异性;通过与实时荧光扩增曲线进行对比,验证了RPA产物可视化检测装置的可行性;最终对20份经实时荧光PCR检测过的血清DNA样本进行RPA可视化检测来评价方法对临床实际样本检测的适用性。结果采用RPA产物可视化检测装置实现了手机拍照肉眼观察即可判定检测结果的阴阳性信号,HBV核酸RPA扩增可视化检测方法可在39℃30 min内实现对低至1-10拷贝HBV DNA靶标的可视化检测,并且特异性良好;对20份血清DNA样本检测的结果与市售qPCR试剂盒的检测结果完全一致,初步验证了方法及装置的实用性。结论基于建立的HBV-RPA扩增体系,结合配套设计的RPA产物可视化检测装置,有望开发出低成本血液HBV核酸现场快速可视化筛查技术平台。

摘要：病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于PCR的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题,已成为目前最主要的病原微生物筛查方法。然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。本文从核酸等温扩增原理、进样方式、检测方式等方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。

摘要：目的通过筛查人21号染色体上的杂合型单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，初步建立基于定量焦磷酸测序反应的唐氏综合征分子诊断方法。方法基于改进引物设计的等位基因特异性扩增法，在21号染色体上选取7个SNP位点进行杂合子筛选，通过焦测序法检测SNP中两个等位基因型的比值，并作为诊断唐氏综合征的依据。结果通过对84名正常中国人基因组样本进行筛查，得到6个杂合率较高的SNP位点，6个SNP位点的杂合子覆盖率为92．9％。应用这6个SNP位点对10例唐氏综合征患者的样本进行了焦测序定量检测，结果表明10例患者样本中有9例样本的两个基因型比值为2：1或1：2，1例未检出杂合子，检出率为90％。结论初步建立了一种唐氏综合征辅助诊断方法，具有成本低、操作简单、快速和结果明了的优点，可以有效地快速诊断唐氏综合征，为今后进一步完善该方法，并将其用于临床诊断奠定了基础。

摘要：目的建立焦磷酸测序检测NUDT15 R139C基因多态性的方法并对其评价。方法设计引物,考察不同退火温度(55、57、60℃),建立NUDT15多态性分型最佳反应条件。检测不同量的*1*15型DNA样本(10、2、0.4 ng),考察方法的灵敏度;比较焦磷酸测序和Sanger测序分型结果,考察方法的准确度;对*1*1型和*1*15型样本重复检测3次,考察方法的重复性。结果明确扩增引物、57℃退火为焦磷酸测序检测NUDT15基因型的最佳条件,最低可检测0.4 ng基因组DNA;焦磷酸测序法和Sanger测序法的分型结果完全一致,方法准确度100%;批内重复3次检测结果完全一致。结论建立了基于焦磷酸测序的NUDT15 R139C基因多态性分型方法,此方法稳定可靠,可投入临床使用并为个体化使用巯嘌呤类药物提供指导。

摘要：建立了一种基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的松材线虫高灵敏可视化闭管检测方法。针对松材线虫核糖体DNA的序列保守区域设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立了环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果表明,本方法可检测到低至10拷贝/管的松材线虫核酸片段,可对单条线虫进行检测,并且具有很高的特异性,能区分检测松材线虫与拟松材线虫。由于整个反应恒温进行,无需热循环仪;闭管检测极大地降低了扩增产物交叉污染的风险;检测速度快,整个检测过程只需40 min,为松材线虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。