摘要：目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰（RNA interference,RNAi）序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA-GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×10^9TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒（0.3641±0.044）相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV-GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低（0.108±0.016,t=16.267,P〈0.001）。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。

摘要：目的探讨p65对神经胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响及相关机制。方法构建p65真核表达载体p IRES2-Zs Green1-p65,设计合成p65基因特异RNA干扰序列si RNA-p65,培养胶质瘤细胞U87,并将p IRES2-Zs Green1-p65、si RNA-p65转染到U87细胞内(对照组分别转染p IRES2-Zs Green1与si RNA-NC),采用Western blotting检测各组细胞中GLUT-3的表达变化;Transwell小室检测胶质瘤细胞U87侵袭能力的变化;CCK-8检测U87细胞增殖能力的变化。结果与转染p IRES2-Zs Green1组相比,转染p IRES2-Zs Green1-p65可以增加p65蛋白与GLUT3蛋白的表达,并增强U87细胞增殖与侵袭能力(P<0.05);与转染si RNA-NC组相比,用si RNA-p65沉默p65基因表达,可以下调P65与GLUT-3基因蛋白水平的表达,并减弱U87细胞增殖与侵袭能力(P<0.05)。结论 p65可以通过调节GLUT-3基因的表达,抑制神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。

摘要：目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。