摘要：目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中Survivin基因表达的抑制作用。方法　设计、合成一对Survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体Psilencer2 1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中Survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制Sur vivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的Psilencer (+) Survivin重组质粒能有效抑制Survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。

摘要：目的构建针对Toll样受体(TLR)4mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264·7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264·7细胞炎症反应的抑制作用。方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNAWizard(http://www·sirnawizard·com/)设计针对TLR4mRNA的寡核苷酸片段。将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA。运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264·7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264·7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化。结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用BbsⅠ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4·9kb和340bp的的条带,后者出现5·0kb和220bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确。将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264·7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%。用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2h:825pg/ml±136pg/ml;8h:2190pg/ml±359pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2h:1179pg/ml±240pg/ml;8h:4720pg/ml±227pg/ml,均P<0·01)。结论针对TLR4mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264·7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用。

摘要：背景:采用胚胎干细胞源性肝样细胞进行移植治疗时,诱导分化的肝样细胞致瘤性及其对肝脏生化代谢的影响有待观察。目的:评价胚胎干细胞源性肝样细胞移植对急性肝功能衰竭模型小鼠的治疗效果。设计:随机对照观察。单位:中山大学附属第一医院。材料:实验于2005-01/2006-02在中山大学附属第一医院中心实验室完成。选用转染绿色荧光蛋白基因的小鼠D3-ES细胞(129系小鼠分离建系),由中山大学眼科中心黄冰教授馈赠。选用40只清洁级6周龄D3-129系小鼠,雌雄不限,由中山大学实验动物中心提供,许可证号码为SCXK(粤)2004-0011,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子为美国GibcoBRL公司产品。方法:①利用转化生长因子、成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子联合诱导小鼠D3-ES细胞分化为肝样细胞,将细胞悬液以2.0×106/只注入20只小鼠肝包膜下,其余20只小鼠作为对照组,仅给予生理盐水注射。②注射后24h,采用5μL/20g四氯化碳腹腔注射,诱发两组小鼠急性肝功能衰竭,观察小鼠生存质量及平均生存时间;急性肝功能衰竭24h,取小鼠后腔静脉血进行总胆红素、谷丙转氨酶、白蛋白、血糖、凝血酶原时间等肝功能指标检测;小鼠死亡后取肝脏标本,观察有无肿瘤生成,应用苏木精-伊红染色和免疫组化观察移植细胞生长和白蛋白表达情况。主要观察指标:①小鼠生存质量及平均生存时间。②肝功能指标检测结果。③移植细胞体内生长及肿瘤形成情况。结果:①小鼠生存质量及平均生存时间:诱发急性急性肝功能衰竭后,对照组先出现共济失调等中枢神经系统症状,对照组14只及移植组8只出现腹水。对照组平均存活时间短于移植组,差异有统计学意义(23,62h,P<0.05)。②小鼠肝功能指标检测结果:对照组及移植组总胆红素及谷丙转氨酶较造模前升高,白蛋白及血糖较造模前低,凝血酶原时间较造模前延长,差异有显著性意义(P<0.01),移植组总胆红素及谷丙转氨酶较对照组下降,血糖较对照组高,凝血酶原时间较对照组短,差异有显著性意义(P<0.05)。③移植细胞体内生长及肿瘤形成情况:移植组小鼠死亡后取肝脏标本做病理切片观察,发现肝脏组织结构无明显改变,无肿瘤形成,移植细胞与小鼠肝样细胞形成很好的排列连接并表达白蛋白。结论:胚胎干细胞源性肝样细胞移植能改善急性肝功能衰竭模型小鼠生活质量,延长小鼠生存时间,移植细胞对肝脏生化代谢起到了较好的支持作用。

摘要：背景:在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件,使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的。目的:验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性。设计:单一样本观察。单位:中山大学附属第一医院。材料:选用BALB/c系小鼠胚胎干细胞(BALB/c-ES)由中山大学实验动物中心建系和保存。分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品,实验用抗小鼠细胞角蛋白7(CK7)和细胞角蛋白19(CK19)购自丹麦DAKO公司,间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品,IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。方法:实验于2004-10/2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成。①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化,在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子,使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化。以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组,使胚胎干细胞自然分化。②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况。③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19,γ-谷胺酰转肽酶(GGT)表达变化,同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点。主要观察指标:①细胞生长及三维环状结构形成情况。②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况。结果:①细胞生长及三维的环状结构形成情况:胚胎干细胞悬浮培养10h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中。分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现一种三维的环状结构,细胞呈同心圆层状排列,内层细胞排列紧密,继续培养,内层细胞逐渐排列疏松,分化20d左右时细胞活力达到最好,其后活力开始下降,分化36d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中。对照组环状结构于第13天出现,细胞结构于27d裂解。②CK7,CK19表达:胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达,分化第13天时CK19表达,其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强。对照组细胞在分化第13,15天开始出现CK7,CK19表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化:加入生长因子后,细胞环状结构形成初始即表达GGT,说明此结构中含有胆管上皮细胞。在环状结构形成初始,细胞间连接紧密,不能分清单个细胞结构,随着培养时间增长,单细胞结构逐渐清晰。GGT阳性细胞呈多角型或方形排列,核位于中央,细胞器较少,胞质染色较浅,符合立方上皮细胞特点,体现出胆管上皮细胞的形态学特点。结论:胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构。

摘要：目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中survivin基因表达的抑制作用。 方法　设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体PSilencer 2 .1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。 结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的PSilencer(+) survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达 ,从而为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。

摘要：目的介导MDR1的RNAi腺病毒载体,探讨RNA干扰MDR1基因对人肝癌细胞的作用。方法根据MDR1mRNA序列构建表达MDR1mRNA特异的shRNA的腺病毒穿梭质粒pshuttle-MDR1。与腺病毒载体体内重组为pAd-MDR1后转染人肝癌细胞SMMC-7721,以FCM检测细胞表面膜蛋白P-gp表达阳性率,以共聚焦显微镜检测细胞内Rh123的潴留,WesternBlot检测P-gp蛋白量的变化。结果构建成pshuttle-MDR1经限制性酶切和PCR证实与设计一致,将pAd-MDR1转染肝癌细胞SMMC-7721后,FCM检测细胞表面膜蛋白P-gp表达阳性率为22.9%和30.8%,远低于对照组(85.8%)。WesternBlot经病毒感染的SMMC-7721/R的P-gp含量明显低于对照SMMC-7721/R,而与SMMC-7721/S细胞接近。结论成功构建了pshuttle-MDR1腺病毒载体,并有效干扰了肝癌细胞细SMMC-7721MDR1的表达。

摘要：目的观察小干扰RNA(siRNA)沉默P-21活化激酶1(PAK1)基因对肝癌细胞的增殖、凋亡及迁移和侵袭能力的影响及其分子机制。方法设计合成针对PAK1的特异性siRNA(siPAK1)和通用无义siRNA序列,转染肝癌细胞,分为siPAK1组和NC组,通过实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)技术和Westernblot法检测肝癌细胞中PAK1的表达;利用细胞计数试剂盒(CCK-8)、流式细胞仪、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验,分别检测其对肝癌细胞生物学特性的影响;利用Westernblot检测肝癌细胞中磷酸化的细胞蛋白调节激酶1/2(p-ERK1/2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)分子的蛋白表达量。结果转染siPAK1能明显抑制肝癌细胞中PAK1的表达;沉默PAK1基因能明显减少肝癌细胞的增殖[NC组:Hep3B(100.00±0.00)%,SMMC-7721(100.00±0.00)%;siPAK1组:Hep3B(30.35±3.44)%,SMMC-7721(41.76±5.91)%(PHep3B=0.018,PSMMC-7721=0.022)]、促进肝癌细胞凋亡(PHep3B=0.004,PSMMC-7721=0.006)并且抑制其迁移(PHep3B=0.028,PSMMC-7721=0.018)和侵袭(PHep3B=0.012,PSMMC-7721=0.006)的能力;沉默PAK1基因可抑制肝癌细胞中p-ERK1/2、bcl-2和CyclinD1分子的蛋白表达量。结论沉默PAK1基因可通过PAK1/ERK通路促进肝癌细胞凋亡,并抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

摘要：目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响. 方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列, 中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1, 构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察. 结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RT- PCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P<0.01). 结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.

摘要：设计说明：荣桂坊作为侨乡的建筑时代的记忆,无疑是当代中国颇具特色的建筑遗存代表。根据荣桂坊更楼和居楼（碉楼中用于居住和防卫的建筑）的历史、人文特征,提炼出具有浓厚区域特色的图形元素。将这些具象和抽象的图形元素与商品和包装进行整合,一方面展示了荣桂坊独特的视觉魅力,另一方面最大程度的与同类商品形成视觉上的差距,从而以最为低成本的方式规避了和解决了当前商品包装所存在的同质化现象。