摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术与同源重组技术在组蛋白去甲基化酶Kdm2b基因的特定位置敲入双loxp序列,为后期制备条件性敲除鼠及基因功能研究提供基础。方法利用CRISPR/Cas9靶向性原理,根据Kdm2b基因第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端设计两个sgRNA,构建sgRNA-PX459重组质粒。从Kdm2b基因上克隆出同源臂,将同源臂插入带有loxp序列的Vector 5中,利用引物从Vector 5质粒克隆得到loxp-同源臂序列的双链Donor DNA。通过脂质体转染将sgRNA-PX459重组质粒和双链Donor DNA导入小鼠NIH3T3细胞,利用嘌呤霉素筛选细胞,挑选阳性单克隆。提取NIH3T3细胞基因组进行PCR,对PCR产物酶切鉴定,同时对Kdm2b基因进行测序。结果电泳和测序结果显示sgRNA-PX459重组质粒构建成功,双链Donor DNA测序结果与设计相符合,成功在NIH3T3细胞Kdm2b基因上第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端各敲入一个loxp序列。结论获得Kdm2b基因敲入双loxp序列的NIH3T3细胞株。

摘要：目的观察CRISPR/Cas9技术在组蛋白去甲基化酶Kdm^(2)b基因大片段敲除小鼠模型构建中的应用效果。方法首先,在Kdm^(2)b基因第7个外显子的5’端和第9个外显子的3’端各设计两个向导RNA(sgRNA),分别插入PX459载体构建重组质粒;将四种sgRNA的重组质粒两两组合(sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2),然后转染入小鼠NIH3T3细胞,筛选出sgRNA3-2和sgRAN5-2为Kdm^(2)b基因敲除的最佳组合。对3~6周龄C57BL/6母鼠进行诱导排卵,使之与公鼠交配,授精成功后处死母鼠,取出受精卵,放入培养液中培养。最后,利用细胞质显微注射技术在小鼠原核期胚胎中注射sgRNA3-2、sgRAN5-2和Cas9的mRNA,将存活的胚胎移植到假孕母鼠输卵管壶腹部。待小鼠出生1周左右,剪取尾尖,用酚/氯仿法抽提尾尖中的基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳及基因测序;纯合子小鼠在出生4周后,观察其表型。结果最终获得13只小鼠。经过基因鉴定,Kdm^(2)b基因大片段缺失的纯合子小鼠1只,杂合子小鼠3只,另外9只Kdm^(2)b基因未见改变;纯合子小鼠鼠尾组织中Kdm^(2)b基因中的外显子7至外显子9基因序列缺失。纯合子小鼠在初生4周后,出现卷尾。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建了去甲基化酶Kdm^(2)b基因大片段敲除的小鼠模型。