摘要：目的建立人类细小病毒B19实时荧光定量PCR核酸检测方法,并对该方法进行系统的方法学验证。方法针对B19病毒3种基因型的高度保守区设计特异性引物和探针,建立B19定量扩增标准曲线。对该方法的准确度、精密度(重复性和中间精密度)、线性范围、定量限、检测限、特异性及防交叉污染,基因分型及抗干扰能力进行验证。结果当B19病毒定量参考品范围为2.0×10^(1)~1.0×10^(8)IU/mL时,实测值与理论值进行双对数回归分析,回归方程R^(2)≥0.98,线性范围相关性良好。定量限为20 IU/mL,检出率100%。检出限为10 IU/mL,检出率95.23%。针对B19病毒3种基因型标本均能有效检出。针对甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人巨细胞病毒、戊型肝炎病毒、梅毒螺旋体7种非B19病原体血浆均为非反应性,种属特异性良好。同时在其他7种同时病原体存在时,弱阳性浓度为E3 IU/mL的阳性标本能够稳定检出,B19核酸检测方法不受干扰。当血红蛋白浓度为431 mg/dL,甘油三酯(1269浊度),非结合性胆红素浓度为20 mg/dL时,本方法针对以上3种常见血浆干扰物质均为非反应性。同时在3种常见血浆干扰物质存在时,弱阳性浓度为E3 IU/mL的阳性标本能够稳定检出,B19核酸检测方法不受干扰。S1(E5 IU/mL)、S2(E4 IU/mL)2个浓度水平标准物质检测值与靶值的偏差均≤±0.5 log值。阳性标本1(浓度水平E5 IU/mL)和阳性标本2(浓度水平E4 IU/mL)日内日间精密度确认和连续5d精密度确认的CV值均≤5%。结论本方法特异性强,灵敏度高,线性范围广,稳定可靠,准确度高,可用于原料血浆中人类细小病毒B19核酸检测。