摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。

摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

摘要：目的探究猪源SIRT5对O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制的影响及其调控FMDV-O复制的初步机制。方法利用Western Blotting和RT-qPCR检测FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5表达情况;设计合成3对SIRT5特异性siRNA,通过Western Blotting和RT-qPCR检测SIRT5、FMDV-O蛋白水平、转录水平及病毒拷贝数的变化情况;构建SIRT5真核表达质粒转染至PK-15细胞,运用Western Blotting、RT-qPCR实验方法探究过表达SIRT5对FMDV-O复制的影响,同时利用RT-qPCR检测过表达SIRT5对SeV、FMDV-O诱导的I型干扰素刺激基因mRNA表达水平的影响。结果FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5的表达上调;siRNA干扰SIRT5抑制FMDV-O的复制;过表达SIRT5促进FMDV-O复制;过表达SIRT5降低了SeV、FMDV-O诱导的干扰素刺激基因mRNA的表达水平。结论FMDV-O感染刺激宿主SIRT5表达,而猪源SIRT5通过抑制I型干扰素刺激基因的产生进而促进FMDV-O复制。本研究为进一步探究猪源SIRT5促进FMDV-O复制的机制提供参考依据。

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建至载体PX459中;将PX459-KLHL34-sgRNA重组质粒转染PK-15细胞,经嘌呤霉素加压筛选、有限稀释法亚克隆挑取单克隆细胞,测序及Western-blot分析鉴定KLHL34基因的敲除情况。用FMDV感染鉴定后的KLHL34基因敲除细胞,利用间接免疫荧光试验、Western-blot、RT-qPCR和TCID50方法综合评价敲除KLHL34基因后对FMDV复制的影响。结果显示,敲除细胞中KLHL34基因发生了碱基缺失突变且引起了目的基因的移码,同时,敲除细胞中均未检测到KLHL34蛋白表达,表明成功构建了KLHL34基因敲除的PK-15细胞系;测定比较了FMDV在KLHL34基因敲除细胞系与对照细胞中的mRNA转录水平、病毒蛋白表达水平及病毒滴度,表明KLHL34基因敲除后显著促进了FMDV的复制。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除KLHL34基因的PK-15细胞系,首次证实KLHL34在抗FMDV复制过程中发挥着重要作用,为后续研究KLHL34调控FMDV复制的机制奠定了基础。

摘要：【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T)细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30(ubiquitin-specific protease 30,USP30)蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA(single guide RNAs,sgRNA),分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。

摘要：利用反向遗传技术对口蹄疫病毒基因的改造和修饰,可以实现对疫苗种毒的生产性能、抗原匹配性、抗原稳定性、免疫应答能力、生物安全性等特征的改良,能够迅速获得预期生物学特性的疫苗候选株,进而可以减少和避免流行毒株驯化环节带来的负面影响。不仅改变了对流行毒株筛选驯化受病毒自然属性制约、费时费力、成功率低的缺陷,而且可以实现更为主动有效的疫苗毒株的设计,对整体提升疫苗品质和效力具有重大意义。本文以口蹄疫病毒为例,从改良疫苗毒株的生物学特性方面进行了综述,为相关研究提供参考和借鉴。

摘要：【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.

摘要：提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmBⅠ/XmaⅠ、XmaⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/NotⅠ、HpaⅠ/KpnⅠ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠcDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pPⅠ-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定。结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾。其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段。将pPⅠFMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应。利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒。

摘要：为了克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因,根据GenBank中登录的PEDV(CV777株)的N基因序列设计1对特异引物,提取阳性临床样品的总RNA,通过RT-PCR方法获得PEDV的N基因。将N基因定向克隆至表达载体pET-28a-His-Sumo中,酶切和测序鉴定表明获得了阳性重组表达质粒pET-28a-His-Sumo-N。将阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并进行IPTG诱导表达,用SDSPAGE和Western-blot对表达的目的蛋白进行分析。SDS-PAGE检测结果表明获得了60.0ku的表达产物,与目的蛋白大小符合;Western-blot结果显示,纯化后的目的蛋白能与PEDV阳性血清发生特异反应。表明成功对PEDV-N蛋白进行了原核表达,且纯化后的蛋白质具有良好的反应原性。

摘要：为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。