摘要：目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体。方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果。结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109Tu/mL。转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低。结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体。

摘要：目的构建含有人神经菌毛素1（NRP-1）基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体，为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒，再将其与酶切线性化的pDC3153Flag载体片段连接，构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag；应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞，产生重组腺病毒，进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定；用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315NRP-1-3Flag的构建；再通过荧光显微镜和Westernblot方法，分别检测质粒pDC315-NRP1-3F1ag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析，证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3F1ag与设计一致；穿梭质粒pDC315-NRP13Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后，经WesternBlot均检测出在95-130ku处有条特征带，其大小和NRP-1-3F1ag融合蛋白（104ku）相吻合；滴度测定为2．00E＋11PFu／mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体，并能在HEK293细胞中表达。

摘要：目的:构建尾型同源盒转录因子2(CDX2)shRNA慢病毒表达载体,并观察下调CDX2基因其对结肠癌细胞生长的影响。方法:根据CDX2 m RNA序列设计shRNA,并合成shRNA的互补序列,通过连接酶链接到GV248载体上,用测序方法鉴定阳性克隆后,将构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装载体用Lpofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒并用稀释法进行滴度测定。将CDX2 shRNA慢病毒表达载体转染人结肠癌细胞SW480、HT29后,分别用q RT-PCR和Western blot检测CDX2 m RNA及蛋白水平,CCK8实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:DNA测序鉴定证实,CDX2 shRNA表达片段正确插入GV248载体中,包装后的病毒滴度为1×109TU/m L;SW480、HT29细胞转染CDX2-shRNA慢病毒表达载体后,CDX2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(均P0.05)。结论:成功构建shRNA慢病毒表达载体,其转染结肠癌细胞后能有效地抑制CDX2基因的表达;下调CDX2基因对人结肠癌细胞的增殖无明显影响。

摘要：目的:比较人端粒酶催化亚单位(hTERT),癌胚抗原(CEA)及巨细胞病毒(CMV)启动子在人结肠癌细胞株LoVo和SW480中的转录活性。方法:设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆hTERT和CEA启动子;用双酶切和PCR法切除原始载体pLVX-EGFP-3FLAG中的CMV启动子后,将hTERT,CEA启动子与该载体重组,构建出重组质粒pLVX-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-CEAp-EGFP-3FLAG;将上述两种质粒及原始载体(含CMV启动子)分别瞬时转染人结肠癌细胞株LoVo和SW480后,检测两种细胞株绿色荧光蛋白表达。结果:经PCR,酶切及测序鉴定,克隆及载体构建完全正确。CMV,hTERT及CEA启动子的转录活性(绿色荧光细胞数/总细胞数)在LoVo细胞中依次为54.7%,33.0%,9.5%;在SW480中依次为16.5%,10.1%,8.5%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:在人结肠癌细胞株中,转录活性以CMV启动子最高,hTERT启动子次之,CEA启动子最低。该结果可为结肠癌的靶向性基因治疗研究提供参考。

摘要：目的构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HREhTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果经PCR和测序分析,pLEGFP-5HREhTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。

摘要：目的对比不同来源一线住院医师所管理的外科手术后患者满意度及术后短期的生活质量,并分析其影响因素,为提供优质医疗服务理念下住院医师培养提供参考。方法将本院一线住院医师分为三类:本院职工一线及外院高资历进修医师(简称高资历医师)、本院专业型硕士研究生(简称专硕)、社会规范化培训医师(简称规培医师)。所有病例均为来自同一临床治疗组并分别由以上三类医师作为住院医师所管理的结直肠癌术后患者。采用自行设计的问卷及引用EORTC QLQ-C30,对2014年1月至2017年10月在我院普通外科住院符合条件的176例患者进行了满意度问卷调查及生活质量评估,问卷回收率为90.3%。结果在患者整体就诊满意度上专硕医师组优于其他两组医师,在短期生活质量上三组患者总体均较高,但高资历医师组有优于其他两组的趋势,而规培医师组介于二者之间。结论医学是一门实践性很强的学科,高资历医师实践经验丰富,临床问题识别处理能力较强,但同患者沟通耐性不足,因此病患术后整体生活质量较高,但满意度偏低。专硕医师专业理论知识牢靠、医患关系单一,具有极高的职业兴趣和对医学未来的憧憬,其与病患沟通充分。因此在住院医师培养过程中,既要重视专业能力的培养,还要强调对患者人文关怀的理念,这样才能给患者提供更加优的医疗服务,有利于我国医学及医患关系向健康稳定的方向发展。