摘要：目的选择适宜的CpG位点用于焦磷酸测序法检测肝癌衰老标记蛋白30(SMP30)启动子甲基化。方法提取人肝癌细胞系SMCC-7721和BEL-7404的基因组DNA,设计针对SMP30基因序列1和序列2的扩增和测序引物,焦磷酸测序法检测SMP30基因序列1和序列2中的CpG位点甲基化程度,并用Sanger测序法验证序列2中出现的SNP位点。结果 SMCC-7721和BEL-7404细胞系中,SMP30基因序列1中6个CpG位点低甲基化,与SMP30基因低表达不符,且测序结果质量评估均为失败。SMP30基因序列2中6个CpG位点高甲基化,与SMP30基因低表达相符,前2个CpG位点均为通过,而后4个CpG位点均为失败。去除第5和第6个CpG位点,只检测SMP30基因序列2中poly(T)结构前4个CpG位点,SMCC-7721细胞系中甲基化程度分别为100%、90%、100%和80%;BEL-7404细胞系中甲基化程度分别为100%、92%、100%和77%。除第3个CpG位点为失败,其余CpG位点均为通过。Sanger测序显示SMCC-7721和BEL-7404细胞系在第3个CpG位点前存在SNP位点,且均为A。结论焦磷酸测序时选择靠近基因转录起始点上游且在poly(T)结构之前的CpG位点,测得的SMP30启动子甲基化值较准确。

摘要：CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。