摘要：旨在通过干扰PPARγ基因的表达,探究PPARγ对绵羊滋养层细胞增殖活性、细胞凋亡、细胞迁移率以及脂质累积的影响,为深入研究PPARγ在绵羊滋养层细胞中的分子机制提供基础依据。本研究设计并合成干扰PPARγ基因的siRNA干扰片段,通过Western Blot和RT-qPCR筛选干扰效率最高的siRNA,并转染至分离培养的绵羊滋养层细胞中。通过BODIPY染色检测干扰PPARγ基因后滋养层细胞中脂滴的聚积,比色法检测细胞中甘油三酯的含量,并利用RT-qPCR检测脂代谢相关基因的转录水平。采用CCK-8法、划痕试验和流式细胞法,分别探究干扰PPARγ基因对滋养层细胞增殖活性、细胞迁移率及细胞凋亡的影响。筛选得到了干扰效率最高的siPPARγ-1片段用于转染滋养层细胞,在干扰滋养层细胞PPARγ基因表达后,细胞中脂滴聚积能力下降,甘油三酯含量降低(P<0.01),脂代谢相关基因CD36、FABP4和PLIN2的转录水平也受到抑制(P<0.01)。同时,滋养层细胞的增殖活力也显著降低(P<0.05),细胞迁移率减少(P<0.01),而细胞凋亡率显著上升(P<0.01)。本研究表明PPARγ基因在调控滋养层细胞功能方面起重要作用,可对其具体分子机制进行深入研究,以期用于繁殖育种实践中。

摘要：为研究NDRG1基因在绵羊生长繁殖中的功能,本实验通过克隆NDRG1基因编码区并分别构建过表达和干扰载体,在细胞水平对其功能进行验证。利用RT-PCR扩增绵羊NDRG1基因CDs区,将其克隆至pcDNA3.1(+)载体构建重组表达载体,设计并构建针对NDRG1CDs区干扰载体,利用内切酶消化法对相关质粒进行鉴定。将构建成功的重组载体转染到HEK293T细胞中,分别利用RT-qPCR和Western Blot方法检测其mRNA和蛋白表达量,确认载体功能。结果显示,NDRG1基因克隆片段为1378 bp,与已发布预测的绵羊NDRG1基因进行比对显示在第1031核苷酸位点发生了G-A突变,氨基酸比对结果显示其同源性为100%。酶切鉴定结果显示,NDRG1表达载体和干扰载体构建成功。RT-qPCR与WesternBlot结果表明,构建的重组载体可介导NDRG1基因在HEK 293T细胞中极显著增高,构建的干扰载体可显著降低NDRG1基因表达水平,其中NDRG1-shRNA3干扰效果极显著且高达90%。本实验成功克隆绵羊NDRG1基因,构建针对该基因的表达载体和干扰载体,并在细胞水平验证其功能,为深入研究NDRG1基因在绵羊细胞中的功能提供基础。