摘要：目的利用改良的CRISPR/Cas9n double nick系统构建DPF2基因敲除的PANC-1人胰腺癌细胞模型。方法设计两对靶向DPF2基因第四外显子上下游的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin真核表达质粒中。将克隆正确的DPF2-sgRNA重组真核表达质粒与Cas9真核表达载体pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9共转染至PANC-1细胞中,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株。提取细胞基因组DNA对敲除位点进行聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定。Western blot检测细胞中DPF2蛋白表达情况。结果sgRNA成功插入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin中且序列正确。PCR扩增鉴定和测序结果表明,PANC-1细胞中一段包括完整第四外显子在内的长度为401 bp的DPF2基因片段被敲除。Western blot检测结果表明,DPF2基因敲除细胞中的DPF2蛋白表达缺失。结论通过改良的CRISPR/Cas9n double nick基因编辑系统成功构建DPF2基因敲除PANC-1稳定细胞株。