摘要：目的运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链（RTA）的拮抗肽，实现在大肠杆菌BL21中的可溶性表达，并对其生物学活性进行评价。方法根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型，在CVFF（consistent-valence force field）、Amber力场下，对RTA的空间构象进行理论模拟，初步确定其生物活性功能域；然后针对该功能域设计小分子拮抗肽，并借助人抗体重链可变区骨架，在CDR3区对拈抗肽进行展示，用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a（＋）；双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定；IPTG诱导人源化的单域抗体表达，用镍离子亲和层析纯化，竞争ELISA和MTr法分别进行结合和中和活性检测。结果从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体，实现了其原核表达，并进行了生物活性检测；建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法。结论研究结果为新型蓖麻毒素小分子拈抗剂的研制奠定了理论和实验基础。

摘要：目的 实现重组蓖麻毒素A链（rRTA）的高效表达,获得rRTA的单克隆抗体,建立基于单抗的蓖麻毒素检测方法.方法 用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子等手段设计引物 用PCR将rRTA基因克隆至载体pE132a（＋） 用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定 IFTG诱导rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定rRTA蛋白 rRTA免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株,获得抗rRTA的单克隆抗体,用Westem blot鉴定.结果 构建了rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,实现了rRTA在大肠杆菌BL21中的高效可溶性表达,获得了高纯度约10～20 mg/L rRTA 获得抗rRTA的单克隆抗体 建立的ricin EIJSA检测方法检出ricin的最低浓度为3.125 ng/mL,目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为6.25 ng/mL.结论 本研究表达的rRTA及其单克隆抗体和基于单抗的ricin检测方法,将在肿瘤生物治疗、ricin生物恐怖袭击的侦检、治疗和预防中发挥重要作用.

摘要：目的用计算机辅助分子设计技术,设计河豚毒素(TTX)小分子拮抗肽,分别用免疫学方法和动物实验进行验证。方法利用计算机辅助分子设计技术,对TTX的空间结构进行了优化;用分子对接确定了TTX关键位点;用分子模建设计了3个能与TTX结合的小分子拮抗肽;分别用竞争ELISA进行免疫学筛选;用动物实验进行中和活性测定。结果成功设计了3个针对TTX的小分子拮抗肽并进行了多肽合成,用竞争ELISA筛选到针对TTX的小分子拮抗肽P2,拮抗肽P2浓度与TTX的结合能力成正比。动物实验中,针对TTX的小分子拮抗肽P2对注射2.5倍半数致死剂量TTX昆明小鼠的保护率为25%,起到了一定解毒效果。结论获得了能与TTX特异性结合的中和性小分子拮抗肽,TTX浓度达到4.05μg/mL(LD50的2.5倍),TTX拮抗肽P2对实验组小鼠的保护率为25%。

摘要：目的:利用自主知识产权抗体3E1,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位,基因工程合成后,动物实验评价绿色荧光蛋白在基于RTB活性肽靶向下在体内的分布,为后续研究奠定基础。方法:用生物信息学技术,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位;分子克隆技术构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体,实现肽-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达;动物实验评价小鼠舌下口服肽-GFP融合蛋白后GFP在体内的分布。结果:建立了自主知识产权单抗3E1与RTB相互作用的空间构象,判定出四个活性区域,构建了4个含不同活性肽的GFP原核表达载体,获得了高纯度蛋白;经舌下口服免疫BALB/c小鼠后,免疫组化和流式细胞术证实,P1-GFP免疫组GFP和CD11c在不同组织中的分布与对照组有明显区别。P1-GFP初次免疫后,GFP主要分布于空肠,再次免疫后,GFP主要集中于回肠、肠相关淋巴组织和小肠PP结;初次免疫后CD11c+细胞主要分布于肠系膜淋巴结,胃和空肠,再次免疫后肠系膜淋巴结中的CD11c+细胞不再占优势,空肠中CD11c+细胞明显增加。结论:基于RTB的活性肽P1与GFP融合蛋白口服免疫小鼠后,P1-GFP经P1肽的导向,初次和再次免疫后GFP在体内的分布不同,再次免疫后范围更广。P1的导向使GFP直接进入小肠PP结和肠系膜淋巴结两个黏膜免疫应答的主要诱导及效应部位,利于免疫应答的发生。

摘要：目的设计并制作2种不同的海水样本采集器，为对海洋微生物进行广谱蒯研、药物敏感性实验等提供适合的样本采集工具。方法通过与文献检索及运用理工科知识，根据阿基米德定律计算并设计图纸，与相关专业公司合作制作完成。结果在实验过程中灵活选用2种采样器完成了对中国海域近千个采样点的样本采集工作，为中国海域细菌谱的调研和药物敏感性分析提供了基础保证。结论“椎底筒式”海水采样器是一种制作相对简单且比较实用的样本采集器，“拖船式”海水采样器是一种信息集成化程度比较高但尚需进一步开发完善的样本采集器。

摘要：目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10^(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。

摘要：目的建立基于mec A／nuc／fem B三基因联合的 Taqman-探针荧光定量 PCR鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法。方法以常规检验标本中分离和采用 VITEK 2 Compact微生物分析仪鉴定为凝固酶阳性的 MRSA为研究对象，通过PrimerPremier5.0和Beacon Designer 7软件设计针对mec A／nuc／fem B特异性PCR引物及Taqman荧光探针，荧光探针5’端分别采用 FAM，HEX及 ROX标记，3’端采用BHQ1标记，在荧光定量PCR仪进行检测。结果①1 g／dl凝胶电泳结果显示mec A／nuc／fem B三个基因引物特异性较好，扩增出的条带分子量与预期分子量一致且未见非特异性扩增；②在单管单通道及单管多通道的 PCR检测中 mec A／nuc／fem B均获得特异性扩增，且三个基因在单管多通道的PCR扩增效果与单管单通道的相类似。结论成功建立了多通道 Taqman-探针荧光定量 PCR鉴定 MRSA的方法， mec A／nuc／fem B三种基因联合检测可有效区分凝固酶阴性和阳性的 MRSA，提高鉴定 MRSA的准确率。