摘要：目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达。方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pm eⅠ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的B J5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达。结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达。结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统。腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞。

摘要：背景：Adeasy腺病毒系统是由***等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统。相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法，其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒，从而简化了腺病毒的构建和测试流程，而且，它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪，从而在近年来被广泛用作基因转染的载体。目的：用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1，并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达。设计：重复测量实验。单位：重庆医科大学儿科研究所。方法：实验于2004-11~005-03在重庆医科大学儿科研究所完成。①重组腺病毒载体的构建：从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1，按Ad—easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0，电穿孔转化感受态XL—1细菌，扩增后获得重组腺病毒质粒，去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞；②腺病毒包装及扩增：PacI酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0，纯化后转染HEK293细胞，观察GFP的表达，待细胞90％以上漂浮后，冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad—hIGF—1（重组目的腺病毒）和Ad-0（重组空白腺病毒），将收集病毒上清重复多次感染293细胞（乒乓交互感染）以提高病毒滴度。③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5％CO2孵箱培养，隔天换液，10d细胞融合达70％～80％，贴壁紧密，细胞形态均一，呈典型的涡漩状排列，传代至第3代按病毒感染复数分组转染。主要观察指标：①腺病毒载体的构建及鉴定。②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度。③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达。结果：①重组腺病毒的鉴定：从质粒pcDNA3．1-hIGF—1中顺利扩增出约400bp大小的清晰条带，与预期相符；pMD18-hIGF—1测序结果经Blast2．0比对与公布序列一致性99．9％（281位碱基同义突变，未影响氨基酸翻译：ggt／ggc—Gly）：pAdtrack—CMV空载体和pAdtrack-hIGF-1分别双酶切（KpnI和HindIH）鉴定正确。质粒pAdEasey—1和Ad—hiGF-1用PacI酶切鉴定鉴定正确。证实病毒质粒同源重组成功。②荧光表达及滴度测定：重组质粒pAd—hIGF-1经PacI线性化后转化HEK293E细胞，48h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达，72h表达最强。约5～7d后细胞出现病毒感染的特征性CPE，由此计算出腺病毒滴度为3．0×10^9pfu／mL。③靶细胞的感染及表达效率：病毒转染骨髓间充质千细胞24h后观察到绿色荧光的表达，72h左右荧光达到最强。免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现。SDSPAGE电泳在7．8KD附近出现明显条带，与实际人胰岛索样生长因子-1分子量7．6kD相符，证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达。结论：本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hIGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-hIGF—1，免疫细胞化学和WesternBlot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达。

摘要：利用一种快速简便经济直接的筛选特异RNA干扰序列的方法,筛选结缔组织生长因子(CTGF)基因特异RNA干扰序列.设计合成分别含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,以pTM1-CTGF为模板PCR获得CTGF基因,定向克隆入pSOS-HUS质粒得到质粒pSOS-HUS-CTGF.质粒pSOS-HUS-CTGF经过SfiⅠ酶切后分别与5条CTGF干扰序列和1条随机对照序列克隆获得pSOS-CTGFi1,pSOS-CTGFi2,pSOS-CTGFi3,pSOS-CTGFi4,pSOS-CTGFi5,pSOS-CTGFicontrol.质粒转入HEK293细胞中,于第1、3、5、7d倒置荧光显微镜照相,IPP图像分析软件测定光强度值.5种CTGF特异RNA干扰载体的相对光强度分别为0.24%、41.47%、2.93%、20.40%和28.85%.特异性序列site1和site3的沉默效果最好.pSOS-HUS系统采用双向启动子,通过绿色荧光蛋白下调水平来衡量干扰序列的沉默效果具有可靠直观重复性好的优点.利用该方法成功筛选了高沉默效果的CTGF特异RNA干扰序列.

摘要：目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。

摘要：背景:血红素加氧酶1在防止和减轻缺血再灌注损伤方面扮演着重要角色,成为目前肝移植领域的研究热点。目的:构建重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1,对肝移植供体进行预处理来诱导供肝血红素加氧酶1高表达,进一步观察其对减体积肝移植大鼠生存时间及肝功能的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-09/2005-03在重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所完成。材料:选用SD大鼠74只,制备原位减体积肝移植模型。方法:利用分子生物学方法构建携带有血红素加氧酶1基因的重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1,对供体进行预处理。将74只大鼠按不同处理方案分组如下:生理盐水组(n=12)、诱导剂原卟啉钴组(n=13)、Ad5-血红素加氧酶1组(n=13)、Ad5-绿色荧光蛋白组(n=12)、Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌组(n=12)分别于取肝前注射生理盐水、诱导剂原卟啉钴、Ad5-血红素加氧酶1、Ad5-绿色荧光蛋白及Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌,取肝后HTK液4℃保存24h后植入。对照组(n=12)取肝前48h静脉注射生理盐水,取肝后马上植入。主要观察指标:各组肝移植大鼠的存活率,肝功能指标测定,彩色多普勒超声监测移植后2h门静脉血流变化,应用常规苏木精-伊红染色法观察移植肝组织病理学变化,肝组织血红素加氧酶1活性测定,应用免疫组织化学染色法检测血红素加氧酶1、肿瘤坏死因子α,bcl-2,bax在移植肝组织中的表达,从分子水平检测血红素加氧酶1、肿瘤坏死因子α,bcl-2,baxmRNA的表达变化。结果:Ad5-血红素加氧酶1组大鼠肝移植后1,7,21d的生存率显著高于生理盐水组(P<0.05)。与生理盐水组、Ad5-绿色荧光蛋白组及Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌组比较,Ad5-血红素加氧酶1组移植肝的谷丙转氨酶活性显著降低(P<0.05),移植后2h内门静脉血流量明显增加(P<0.05),血红素加氧酶1活性显著升高(P<0.05),反转录-聚合酶链反应和免疫组化检测中血红素加氧酶1、Bcl-2表达水平增高(P<0.05),Bax、肿瘤坏死因子α表达水平降低(P<0.05)。结论:构建重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1可以诱导供肝血红素加氧酶1高表达,显著增加大鼠减体积肝移植后2h内门静脉血流,促进移植肝功能的恢复,从而延长肝移植后的生存时间。

摘要：目的探讨肝母细胞瘤发生的危险因素，包括婴儿出生以及孕产妇分娩相关的特征。方法采用病例对照研究设计，收集肝母细胞瘤患儿及其母亲的病历资料，用Logistic回归模型对婴儿出生特征指标、母亲怀孕与分娩有关指标进行多因素统计检验。结果发生肝母细胞瘤风险中低出生体质量儿的比值比为26．0（95％可信区问为14．0～65．7）。母亲≤20岁和≥30岁的比值比分别为1．5（95％可信区间为0．6～4．6）和2．6（95％可信区间为1．0～6．7）。超重和肥胖母亲的比值比为3．2（95％可信区间为1．0～6．7）。孕妇吸烟的比值比为2．9（95%可信区间为1．1～4．2），对〉2岁及出生体质量正常儿童影响较大。结论肝母细胞瘤的发生与患儿出生体质量及孕妇超重、吸烟等因素有关，应重视围产期卫生保健。

摘要：目的　探讨白血病细胞多药耐药发生的分子机理,寻找新的多药耐药相关基因。方法　以HL- 6 0细胞为“驱动方”,以多药耐药细胞系HL- 6 0 / VCR为“实验方”,建立人白血病多药耐药细胞系HL-6 0 / VCR抑制消减杂交文库,利用基因芯片技术从中筛选出一条在野生型HL - 6 0细胞中基本不表达,而在HL - 6 0 / VCR耐药细胞中呈低丰度差异表达的新表达序列标记序列。用表达序列标记拼接的同源基因克隆法得到人类新基因HV12 6序列,再利用生物信息学数据库和软件对其进行功能的预测和分析。最后针对推导序列开放阅读框设计引物,逆转录-聚合酶链反应检测推导HV12 6基因序列在临床白血病患者化疗前后白血病细胞中的表达。结果　HV12 6的c DNA序列长1991bp,编码36 5个氨基酸,其编码蛋白序列局部与新近发现的在细胞凋亡与炎症反应中起重要作用的蛋白基序“PYRIN”存在约4 3%的相似性。逆转录-聚合酶链反应结果提示该基因与白血病细胞受化疗药物的作用和耐药存在联系。结论　HV12 6可能是与白血病细胞耐药相关的一条新基因,有必要对该基因进行进一步的实验室克隆与功能研究。

摘要：目的探讨钙视网膜蛋白在3个月内婴儿先天性肠无神经节细胞症（HD）的临床诊断价值;对采用经肛门直肠结肠斜形切除吻合术治疗3个月内婴儿HD进行随访及疗效评价。方法 2008年1月至2014年10月该院确诊并行了经肛门直肠结肠切除斜形吻合术或肠造瘘术治疗3个月内婴儿HD 192例,收集其病案资料,并行根治术中期随访,评价其肛直肠功能及生活质量。结果 192例HD患儿中,139例行经肛门直肠结肠切除斜形吻合术,53例行肠造瘘术。术前诊断依据典型病史、体格检查及辅助检查,包括钡剂灌肠、直肠肛管测压和直肠吸引活检钙视网膜蛋白免疫组织化学染色,阳性率分别为80.1%、92.1%、97.9%。66例（60.5%）获中期随访,小肠结肠炎2例（3.0%）,污粪2例（3.0%）,无便秘复发、大小便失禁、肛门狭窄,男性患儿均有阴茎勃起现象,生长发育与正常婴幼儿相当。门诊随访25例,生化检查均在正常范围,15例钡剂灌肠检查显示肠道形态恢复良好;直肠肛管测压11例,10例（90.9%）肛门松弛反射恢复正常,1例未见松弛反射。结论钙视网膜蛋白免疫组织化学染色检查可作为3月内婴儿HD术前诊断的金标准;经肛门直肠结肠斜形切除吻合术设计符合生理,并发症少,中期疗效满意,适合0~3个月小婴儿根治术。

摘要：目的　了解各种小儿肿瘤分子病理学特征及增殖活性， 为临床早期诊断制定合理的化疗方案及估计预后提供实验依据。方法　用流式细胞术及免疫组织化学测定１００ 例近５ 年各类小儿肿瘤石蜡标本ＤＮＡ含量及Ｋｉ６７ 的表达。结果　ＤＮＡ含量、Ｋｉ６７ 表达与组织学分级呈明显的线性关系（Ｐ＜ ０．０５） ，ＤＮＡ 含量越高，Ｋｉ６７ 表达越高， 组织学分级越高。结论　ＤＮＡ 含量测定在小儿实体恶性肿瘤的诊断中具有重要意义，ＤＮＡ含量及Ｋｉ６７ 可独立作为小儿肿瘤病理学指标判断肿瘤恶性程度及预后， 并为化疗方案的设计提供资料。