摘要：目的表达与纯化人磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1),为后续研究奠定基础。方法用SnapGene设计5′侧翼添加Nde I和Xho I位点的上、下游引物,PCR扩增cDNA,扩增产物与质粒pET-28a经Nde I和Xho I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA ligase连接cDNA和pET-28a,热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α,转化产物涂布于含卡那霉素(Kanamycin)的LB平板(LBK板),筛选抗性菌落。于含卡那霉素的LB培养基(LBK培养基)培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。将重组质粒同法转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选抗性菌落。将一个抗性菌落接种于LBK培养基,37℃250r/min培养至OD约0.8。用0.1mmol/L IPTG,16℃诱导PGAM1表达20h。收集细胞,超声破碎,离心取上清,用Ni-NTA试剂盒纯化PGAM1。超滤浓缩纯化的PGAM1,并用不含咪唑的缓冲液进行交换,降低PGAM1溶液中的咪唑浓度。BCA法测定PGAM1浓度,保存PGAM。结果重组质粒pET-28a-PGAM1构建成功,基因工程菌pET-28a-PGAM1-BL21(DE3)经IPTG诱导,PGAM1获得可溶性表达,产量达120mg/L。结论高纯度、高产的PGAM1为后续研究奠定了坚实基础。

摘要：目的本研究拟在大肠埃希菌中表达并纯化人磷酸丙糖异构酶(TPI),为其后续研究奠定基础。方法根据TPI编码序列(CDS)设计一对引物,其5′端分别添加Nde I和Xho I位点,PCR扩增TPI CDS。Nde I和Xho I酶切PCR产物和质粒pET-28a,胶回收酶切的质粒和PCR产物,并用DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,用含卡那霉素的抗性平板筛选抗性菌落。将抗性菌落接种于含卡那霉素的LB培养基,于37℃250r/min培养过夜,抽提质粒,双酶切和测序鉴定重组质粒pET-28a-TPI。将重组质粒pET-28a-TPI转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,于含卡那霉素的抗性平板筛选抗性菌落。将一个抗性菌落接种于100mL含卡那霉素的LB培养基,于37℃摇床中250r/min培养至A600约0.9,加入0.1mmol/L IPTG诱导TPI表达4h,收集菌体,超声裂解细胞,裂解液上清中的TPI用Ni^(2+)亲和层析柱纯化。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的表达产物,纯化的TPI经超滤浓缩后,保存于-20℃。结果pET-28a-TPI序列正确,可溶性TPI在大肠埃希菌中获得表达,产量达300mg/L,纯度约90%。结论高产率、高纯度的TPI为后续研究奠定了良好基础。

摘要：设计一对3′端互补、5′端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将载体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21(DE3)。诱导重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性。试验成功构建了重组载体pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600 nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9 h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5;酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L。

摘要：目的表达人6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)并建立其体外抑制剂筛选模型。方法设计一对5′端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物,PCR扩增G6PD cDNA。将cDNA和质粒pET-28a经NdeⅠ+XhoⅠ酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌Top10。将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.4 mmol/L IPTG诱导G6PD表达,镍离子亲和层析柱纯化G6PD。以6-磷酸葡萄糖(G6P)和烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸(NADP+)为G6PD的底物和辅因子,检测340 nm波长处光吸收值(A_(340))的变化,确定G6PD及其抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)的最佳浓度,计算模型的可靠性指数—Z′因子。结果构建了重组质粒pET-28a-G6PD,重组菌BL21(DE3)-pET-28a-G6PD经IPTG诱导后,可溶性G6PD表达量为2.5 mg/L,G6PD、DHEA的最适浓度分别为900μg/L、20μmol/L,筛选模型的Z′因子为0.88。结论在大肠杆菌中表达了有活性的G6PD,建立了可靠的体外抑制剂筛选模型。

摘要：目的用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础。方法用Snapgene设计一对5′分别附加Nde I和Xho I位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde I+Xho I酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落。于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h。超声破碎细胞,离心取上清,用Ni^(2+)-NTA试剂盒纯化ALDOA。超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度。BCA法测定重组ALDOA浓度并保存。结果大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L。结论高产量、高纯度的ALDOA为后续酶学研究奠定了坚实基础。

摘要：目的利用基因工程制备重组人唾液淀粉酶A(rSAA),用其替代唾液中的SAA水解淀粉。方法设计一对带酶切位点的引物,PCR扩增SAA cDNA全长,将pET-28a质粒和PCR产物双酶切、连接。连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α,于含卡那霉素的LB平板筛选抗性菌落,培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。将重组质粒(记为pS1)转化大肠杆菌BL21(DE3),用含卡那霉素的LB平板筛选抗性菌落(记为BL-pS1),培养BL-pS1,ITPG诱导rSAA表达。收集菌体,重悬于pH6.8的磷酸缓冲液,超声裂解,离心取上清,测试其水解淀粉的活性。结果构建了SAA cDNA的原核表达载体pS1,rSAA在宿主菌BL21(DE3)中获得可溶性表达,rSAA能高效水解淀粉。结论用rSAA取代唾液中SAA水解淀粉操作安全、取用方便、利于环保。

摘要：目的研究敲低和过表达LDHB(lactate dehydrogenase B)对HeLa细胞生长的影响。方法根据慢病毒质粒pLn(pLL3.7-neo)特点,设计三对分别靶向LDHB c DNA 48,201,443位核苷酸序列的shRNA(short hairpin RNA)引物,退火后与pLn重组。同时,将LDHB cDNA与慢病毒质粒pIp(pBOBI-IRES-puro)重组,获得的重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将获得的病毒上清感染HeLa细胞,Western blot鉴定LDHB的敲低和过表达对LDHB蛋白水平的影响,并观察其对HeLa细胞生长的影响。结果靶向LDHB第48位核苷酸的shRNA显著敲低LDHB(P<0.01),443位次之,201位无敲低作用。shRNA序列对HeLa细胞生长的抑制作用与其敲低效果成正相关。转染pIp-LDHB显著升高LDHB在HeLa细胞中的表达水平(P<0.01),但不影响其生长。结论敲低LDHB抑制HeLa细胞生长,下调LDHB的表达可能有助于宫颈癌的治疗。

摘要：目的在毕赤酵母中表达唾液富组蛋白5(HRP5)基因原始序列hrp5及突变序列hrp5′(Lys17→Asn),比较表达量及抗白色念珠菌活性。方法选用毕赤酵母偏爱密码子,设计3′端互补、5′端带酶切位点的两对引物,PCR合成hrp5和hrp5′,克隆至pPICZα-A,转化大肠杆菌,将酶切、测序鉴定的阳性重组质粒pPICZα-A-hrp5和pPICZα-A-hrp5′经SacI线性化后电击转化GS115,筛选阳性菌落,PCR鉴定,甲醇诱导表达,比较抗菌活性,测定表达量。结果hrp5及hrp5′正确整合到GS115基因组中,突变前后表达产物与HRP5标准品活性相当,表达量分别为4μmol/L、5μmol/L。结论HRP5在毕赤酵母中成功表达,活性区Lys17突变为Asn使表达量提高25%,而对其杀菌活性无影响。

摘要：目的将唾液富组蛋白5(histatin5)的cDNA克隆至T载体,获取大量酶切后的目的片段。方法选用大肠杆菌偏爱密码子编码histatin 5氨基酸,设计5′端带酶切位点、3′端互补的两条引物,通过overlap PCR获取histatin 5的cDNA,将cDNA与T载体连接后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,PCR、酶切、测序鉴定。酶切重组T载体,获取目的片段。结果Histatin 5的cDNA正确克隆至T载体,无突变。结论克隆载体构建成功,有利于目的片段的酶切和回收。

摘要：提出了研究碳烟的生成和氧化历程及工作条件影响的方法。将Surovikin碳烟生成模型和Nagle碳烟氧化模型集成在ICFD-CN源程序中构建多维模型,采用数值循环模拟的方法,根据不同的工作条件计算碳烟的生成和氧化历程。结合试验数据分析和比较进气温度、空燃比、负荷、转速和喷油提前角对碳烟生成和氧化历程的影响。研究表明:用数值模拟的方法反映了1137柴油机碳烟的生成和氧化历程以及设计参数对碳烟的生成和氧化的影响规律,对柴油机的设计具有参考价值。