摘要：目的扩增BMP2基因下游110kb处的预测有增强子功能的非编码序列,将其插入pGL3-promoter载体,构建该长片段的真核表达系统。方法在所设计的上下游引物的5’端加入BamHⅠ酶切位点,采用聚合酶链反应(PCR)的方法从短指畸形患者外周血提取的DNA中扩增BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列。首先将扩增的目标片段与PGEM-T载体连接,连接产物转化DH5α感受态细菌,经蓝白斑筛选出的阳性克隆通过电泳、酶切鉴定后进行测序验证是否为插入的目标序列,测序正确后提取重组质粒。利用限制性内切酶BamHⅠ同时酶切插入目标序列的质粒和pGL3-promoter载体,将酶切完全的目标序列与线性pGL3-promoter空质粒载体在Solution I快速连接酶的作用下进行连接反应,构建目标序列的真核表达载体。结果经过酶切和测序证实含有4.8kb长的目标序列的分子克隆和真核表达载体构建成功。结论实验成功克隆了BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列,并构建了pGL3-promoter-enhancer真核表达载体,为进一步验证该序列可能的调控功能奠定了基础。

摘要：目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本(包含不同基因突变型别)、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例(74/229,32.31%)YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例(44/229,19.21%)rtM204V突变,25例(25/229,10.92%)rtM204I突变,5例(5/229,2.18%)rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例(47/229,20.52%)rtM204V突变、25例(25/229,10.92%)rtM204I突变和2例(2/229,0.87%)rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%(71/74),部分符合率为4.05%(3/74)。2种方法的一致性(κ)为0.97(P<0.01)。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。