摘要：目的:获取含凋亡基因fas表达调控元件cdc25A片段和fas开放阅读框架的cdc25A-fas嵌合基因,构建和鉴定真核表达载体pAdTrack-CMV-cdc25A-fas和pAdTrack-cdc25A-fas,为将口腔鳞癌细胞固有的促细胞增殖信号转变为促细胞凋亡信号的研究奠定基础。方法:根据fas基因、cdc25A已知序列设计合成引物,采用PCR技术从pBLF58-1质粒中扩增得到嵌合基因cdc25A-fas;然后定向克隆至真核表达载体pAdTrack-CMV和pAdTrack,分别转化大肠杆菌***5α感受态细胞;卡那霉素筛选阳性克隆;进行PCR、酶切鉴定和序列分析。结果:PCR扩增得到特异的1603bp的cdc25A-fas片段;筛选并鉴定得到含pAdTrack-CMV-cdc25A-fas和pAdTrack-cdc25A-fas的大肠杆菌***5α阳性克隆。结论:成功构建了真核表达载体pAdTrack-CMV-cdc25A-fas和pAdTrack-cdc25A-fas,为下一步研究其在肿瘤基因治疗中的作用奠定基础。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存在怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用。设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300g6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型。方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用。取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组。主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平。结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后,部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞呈节律性跳动,呈心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性。对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变,其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性。结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟。

摘要：背景:粒细胞集落刺激因子是骨髓造血干细胞的强有力的动员剂,已经证实粒细胞集落刺激因子具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力。目的:观察应用粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进入脑梗死部位,对缺血性脑梗死大鼠的治疗作用。设计:随机分组设计、动物实验。单位:中山大学干细胞与组织工程中心。材料:实验于2004-09/2005-01在中山大学(北校区)动物实验部和中山大学干细胞与组织工程中心完成。选择雄性Wistar大鼠200只,随机分为自体骨髓干细胞移植组和对照组,每组100只。方法:两组均用线栓法制作大鼠缺血脑梗死模型。自体骨髓干细胞移植组于复制缺血脑梗死模型后1h腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子(60μg/kg)。对照组于术后1h腹腔注射等量生理盐水。①术前及术后24h,48h,1周测各组大鼠的体质量,计算体质量减轻率_并对大鼠进行神经病学分级。分级标准:0级:正常_1级:对侧前肢屈曲_2级:提尾时,对侧前肢抓力减弱_3级:自主运动无方向性,提尾时向对侧旋转_4级:自主运动时,向对侧旋转。②将两组大鼠各取15只,分别于术后24,48h和1周开颅取脑,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积、苏木精-伊红染色检查脑组织病理变化、免疫组织化学检测CD34阳性细胞浸润情况。主要观察指标:体质量减轻率,神经病学分级,脑梗死体积,脑组织病理变化,CD34阳性细胞浸润情况。结果:纳入动物200只,造模成功180只,造模后1～7d死亡48只,存活132只,随机选择120只进入结果分析。①体质量测定、神经病学分级:术后24h,48h两组大鼠体质量减轻率比较差异无显著性(P<0.05);术后1周自体骨髓干细胞移植组体质量减轻率显著低于对照组,差异显著[分别为(10.5±8.2)%,(17.8±7.1)%,P<0.05]。自体骨髓干细胞移植组的神经损伤与对照组比较差异无显著性。②梗死灶体积:对照组梗死灶体积和梗死灶体积占全脑体积百分比高于自体骨髓干细胞移植组,差异显著[分别为(251.69±52.77),(145.72±28.05)mm3,(17.00±2.69)%,(9.90±1.62)%,P<0.01]。③病理学改变:术后24h,两组大鼠均出现典型的脑缺血梗死病理变化,自体骨髓干细胞移植组大鼠的梗死区可见少量单个核细胞,而对照组则无。术后48h神经细胞大片消失,胶质细胞变性,自体骨髓干细胞移植组有大量单个核细胞浸润,对照组相对较少。1周后对照组梗死区脑组织液化变软,坏死灶周围可见较多的单核和淋巴细胞浸润_自体骨髓干细胞移植组大鼠部分坏死灶被新生毛细血管和胶质细胞增生修复,炎性细胞浸润不明显。④免疫组织化学检查:术后24h,自体骨髓干细胞移植组大鼠的手术侧脑组织中检测到CD34阳性的单个核细胞,对侧脑组织及对照组大鼠的脑组织无此类细胞。术后48h,自体骨髓干细胞移植组手术侧脑组织除有CD34阳性单个核细胞浸润,还发现呈锥形并且带有突起的CD34阳性细胞。对侧脑组织、对照组大鼠的脑组织均未见CD34阳性细胞。结论:粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进行自体干细胞原位移植治疗,可以减轻大鼠缺血性脑梗死程度,减少脑梗死体积。

摘要：目的 :利用RNA干涉技术抑制雄激素受体 (AR)的表达 ,研究AR在激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞增殖中的作用。方法 :设计、合成针对AR的 4种不同的小干涉RNA(siRNA) ,连接到带有人H1启动子的腺病毒载体质粒pShuttle -H1-Ri中 ,构建成能产生AR -siRNA的质粒pShuttle -H1-Ri-AR ,与能表达AR的质粒pcDNA -AR共转染HEK2 93细胞 ,Westernblot检测不同的siRNA对AR表达的抑制效率 ,选取抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒 ,感染LNCap、C4 - 2B和CWR2 2Rv13种对雄激素有不同反应性的人前列腺癌细胞 ,采用Westernblot检测感染后细胞中AR的表达程度 ,并用MTT比色法测定细胞的增殖活性。结果 :4种siRNA都能抑制共转染AR的表达 ,用抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒感染 3种靶细胞后 ,均能特异性地抑制 3种细胞中AR的表达 ,细胞的增殖活性也随之明显下降。结论 :AR -siRNA通过抑制激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞中AR的表达 ,有效地抑制细胞的增殖 ,AR对维持激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖活性具有十分重要的作用 ,是治疗前列腺癌的重要靶分子。