摘要：目的建立永生化的人巩膜成纤维细胞系,并利用转录组测序分析永生化的影响。设计实验研究。研究对象实验组为永生化人巩膜成纤维细胞,对照组为原代人巩膜成纤维细胞。方法采用携带SV40 T基因质粒及lenti-Mix慢病毒包装质粒,利用磷酸钙转染法转染HEK293T获得慢病毒颗粒。用获得的慢病毒颗粒转染原代细胞,暴露于含有1μg/ml嘌呤霉素中2天,存活的细胞继续在培养基中体外培养至25代,获得永生化的人巩膜成纤维细胞系。之后,对永生化前后的细胞进行RNA提取及测序,分析永生化细胞与原代细胞转录本特性。使用DESeq包分析差异基因,并使用Clusterprofiler进行基因本体(GO)分析。主要指标细胞形态、胶原蛋白相关基因表达量和转录本相关性。结果永生化人巩膜成纤维细胞保持了原代细胞的形态,并呈现显著增强的增生能力,成功培养20代以上。永生化细胞与原代细胞的转录组高度相似,RNA测序显示两者相关性为r2=0.995。基于DESeq包的差异基因分析显示转录本共比对出22930个基因及33691个异构体,其中有2063(3.6%)个基因的表达呈上调趋势,2776(4.9%)个基因的表达呈下调趋势。GO功能分析结果显示,上调的基因主要聚集在DNA复制、细胞分裂等细胞基础代谢活动及与病毒的相互作用,下调的基因主要富集于细胞外基质调节与细胞间连接等通路。细胞外基质相关基因通路中,编码胶原蛋白、纤维蛋白基因转录略微下调(log2倍数变化=-0.4~-3.1),COL1A1转录量下调3.34倍。结论本研究中利用慢病毒转染法通过导入SV40T外源基因的方式构建了永生化的人巩膜成纤维细胞系,与原代细胞相似性高,稳定性好,可为巩膜相关实验提供充足的研究材料。