摘要：目的:建立金铁锁β-actin基因实时荧光定量PCR方法,为金铁锁实时荧光定量PCR的检测提供了内参基因。方法:根据Gen Bank上β-actin基因保守区域设计特异性引物,利用PCR扩增的方法扩增β-actin目的片段。并以β-actin作为内参基因,利用荧光定量PCR技术对糖基转移酶基因(UGT)在金铁锁根、茎、叶组织中的表达情况进行分析。结果:扩增到金铁锁的β-actin基因序列,长度为153 bp,与王不留行、鹅肠菜、马齿苋的β-actin有较高的同源性。而糖基转移酶基因在以β-actin作为内参基因时能够在金铁锁的不同组织稳定表达。结论:金铁锁β-actin基因是一个可靠的内参基因,适合在金铁锁三萜皂苷生物合成相关功能基因的表达研究中作为内参基因。

摘要：目的从金铁锁Psammosilene tunicoides *** et ***中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶基因FPS,进行序列特征分析和不同组织中的表达情况。方法根据已获得的金铁锁转录组数据,设计FPS基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得金铁锁FPS基因的全长c DNA序列,并进行TA克隆、序列分析及原核表达;并设计Real-time PCR扩增引物,测定FPS在不同组织中的表达量。结果 FPS c DNA全长1135bp,开放阅读框1029bp,编码342个氨基酸;构建了p EASY-E1-FPS重组质粒,获得稳定的原核表达体系。Real-time PCR结果表示FPS基因在根中的表达量高于叶和茎。结论成功克隆了金铁锁FPS基因,构建了稳定的p EASY-E1-FPS原核表达体系,FPS基因的表达分析表明,FPS在金铁锁不同组织均有表达,根中表达量最高。为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。

摘要：目的:优选金铁锁的提取工艺。方法:采用正交试验法,以金铁锁提取物提取率为主要考察指标,结合生产成本,对影响金铁锁提取工艺的因素进行了研究。结果:试验设计三因素中提取方式有显著影响。结论:金铁锁的最佳提取工艺为:金铁锁根粉用80%乙醇浸渍3次,48 h/次,过滤,滤液减压浓缩成浸膏,加水溶解,水溶液经DM-101型大孔吸附树脂柱层析,分别用10%、20%及80%的乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩经喷雾干燥得金铁锁提取物。

摘要：目的:从金铁锁Psammosilenetunicoides *** et ***中克隆细胞色素PtCYP450酶基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据已获得的金铁锁转录组数据,设计PtCYP450基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得金铁锁PtCYP450基因的全长cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建金铁锁PtCYP450-03基因的原核表达载体pEASY-E1-CYP450,转入BL21(DE3)Chemically Competent Cell中,在Art Media^(TM)Protein Expression培养基中进行蛋白表达。结果:获得全长1612 bp的金铁锁CYP450 c DNA,其开放阅读框(ORF)为1560 bp,编码519个氨基酸;序列分析及系统发育分析表明,PtCYP450基因属于CYP710家族成员。构建了p EASY-E1-CYP450重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。结论:成功克隆了金铁锁PtCYP450基因,构建了稳定的pEASY-E1-CYP450原核表达体系,为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关键酶表达模式奠定基础。