摘要：α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)广泛分布于中枢和外周神经系统,与多种神经系统疾病、炎症反应密切相关。α-芋螺毒素[A10L]PnIA作为靶向α7 nAChR的拮抗剂,对研究α7 nAChR相关生理、病理过程具有重要作用。利用荧光素5-羧基四甲基罗丹明标记[A10L]PnIA,体外两步法氧化折叠获得活性肽([A10L]PnIA-F)。利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系和双电极电压钳技术检测[A10L]PnIA-F荧光肽的活性。同时,利用小鼠巨噬细胞和CCK8检测其细胞毒性。合成的[A10L]PnIA-F荧光肽,质谱鉴定其分子质量为2077.28 Da,与理论值一致;电生理测定其对鼠源α7 nAChR的半阻断剂量(IC50)为17.32 nmol·L^(-1),较[A10L]PnIA本体(IC50,13.84 nmol·L^(-1))基本保持一致;细胞毒检测结果显示,在5 nmol·L^(-1)~10μmol·L^(-1)的浓度范围内,对小鼠巨噬细胞的生长无显著抑制。结果表明α-芋螺毒素荧光探针[A10L]PnIA可以为α7 nAChR相关的神经生理、病理机制的研究提供工具。

摘要：目的探究作用于α6/α3β2β3烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的α-芋螺毒素TxIB对吗啡/尼古丁诱导条件性位置偏爱(CPP)的影响,为进一步设计筛选抗药物依赖的芋螺毒素提供理论和实验依据。方法选用SPF级雄性C57BL/6小鼠,采用皮下注射吗啡(5 mg/kg)或尼古丁(0.5 mg/kg)建立CPP模型。侧脑室注射不同剂量的α-芋螺毒素TxIB,记录小鼠在伴药箱的停留时间。结果皮下注射吗啡(5 mg/kg)或尼古丁(0.5 mg/kg)均可成功建立CPP模型,经侧脑室注射不同剂量的TxIB后测值,发现TxIB能显著性抑制吗啡/尼古丁诱导小鼠CPP的表达(P0.05)。结论α-芋螺毒素TxIB可以抑制吗啡/尼古丁诱导小鼠CPP的表达,有望进一步开发成为戒烟戒毒的候选新药。

摘要：目的对特异区分α6/α3β2β3和α3β22种nAChRs亚型的α-CTx LvIA进行研究,确定影响其活性的关键氨基酸位点。方法通过序列比对,两步法氧化折叠、双电极电压钳和圆二色谱等技术确定Lv IA中影响其活性的关键氨基酸位点,并探索该位点对Lv IA影响的机制。结果确定了Lv IA中第5位组氨酸(His,H)的关键作用,当第5位的His分别被丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)和色氨酸(Trp,W)分别取代后,都会导致Lv IA对所有受体亚型的活性丧失。圆二色检测结果表明该位点的变化对Lv IA的二级结构没有显著影响。结论第5位His是维持Lv IA活性的关键氨基酸残基,该氨基酸极性和侧链的变化均会导致Lv IA活性的丧失,但是对其二级结构影响较小。Lv IA中第5位氨基酸与nAChR的相互作用力是保证其活性的关键。该结论为基于Lv IA设计新型专一作用于乙酰胆碱受体的工具探针改造提供了重要信息。

摘要：为了检测烟碱型乙酰胆碱受体(nicotine acetylcholine receptors,nAChRs)α7亚基基因(CHRNA7)的表达,笔者根据人源CHRNA7基因序列设计引物,PCR扩增CHRNA7基因,亚克隆到pMD-18T载体中后,测序鉴定并制备重组质粒,以梯度稀释的重组质粒为模板,进行荧光定量PCR来绘制标准曲线,并进行灵敏度和重复性实验,成功建立了检测CHRNA7基因的荧光定量PCR方法。该方法最低可检测10 1 copies·μL^-1,且重复性良好,在10 4,10 5,10 6 copies·μL^-1时,5次重复的变异系数分别是1.22%,1.90%,2.63%。此外,还对人宫颈癌细胞SiHa和人正常宫颈细胞Ect1/E6E7中α7 nAChR亚基基因表达量进行检测,结果显示,α7 nAChR亚基在SiHa细胞系的表达明显低于其在Ect1/E6E7细胞系中的表达(P=0.015)。

摘要：目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件。方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化。结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp。结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α-芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础。

摘要：芋螺毒素和微生物的次生代谢产物与植物的生物碱一样,具有生物多样性的特点。芋螺毒素特有的二硫键骨架和化学修饰后特异的空间结构,使其具有特异的稳定性和药理学活性。对芋螺毒素基因的分析和新型基因的克隆筛选,是深入研究各种受体、离子通道及其亚型,进而在克隆表达的靶受体上设计和筛选高效新药的前提。芋螺毒素基因资源的研究在芋螺毒素新基因及其编码产物毒素肽的发现与利用方面发挥了重要作用。现对该领域的新进展进行论述。

摘要：为了进一步探究第11位氨基酸的性质对LvIA靶点结合活性的影响,设计了LvIA的2个新型突变体[D11R]LvIA和[D11H]LvIA,即用2个碱性氨基酸-精氨酸(R)和组氨酸(H)分别替换原来的酸性氨基酸D。先人工合成了这2个新突变体的线性肽,然后采用2步氧化法进行折叠,以获得在第1位和第3位半胱氨酸(Cys 1~3)、第2位和第4位半胱氨酸(Cys 2~4)之间定点连接形成二硫键。经高效液相色谱分离纯化和质谱鉴定,合成了含有Cys(1~3, 2~4)二硫键连接方式的多肽,其分子质量正确,纯度在95%以上。利用双电极电压钳电生理学技术对这2种突变体与α3β2 nAChR的结合活性进行了检测。结果发现,当该位点的氨基酸性质由酸性转换为碱性后,对LvIA的活性影响巨大,直接导致对α3β2 nAChR的阻断活性丧失。[D11R]LvIA和[D11H]LvIA的活性与野生型LvIA相比分别降低了574.38%和408.62%。由此表明,第11位氨基酸的酸碱性对LvIA的活性至关重要。