摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

摘要：目的探究猪源SIRT5对O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制的影响及其调控FMDV-O复制的初步机制。方法利用Western Blotting和RT-qPCR检测FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5表达情况;设计合成3对SIRT5特异性siRNA,通过Western Blotting和RT-qPCR检测SIRT5、FMDV-O蛋白水平、转录水平及病毒拷贝数的变化情况;构建SIRT5真核表达质粒转染至PK-15细胞,运用Western Blotting、RT-qPCR实验方法探究过表达SIRT5对FMDV-O复制的影响,同时利用RT-qPCR检测过表达SIRT5对SeV、FMDV-O诱导的I型干扰素刺激基因mRNA表达水平的影响。结果FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5的表达上调;siRNA干扰SIRT5抑制FMDV-O的复制;过表达SIRT5促进FMDV-O复制;过表达SIRT5降低了SeV、FMDV-O诱导的干扰素刺激基因mRNA的表达水平。结论FMDV-O感染刺激宿主SIRT5表达,而猪源SIRT5通过抑制I型干扰素刺激基因的产生进而促进FMDV-O复制。本研究为进一步探究猪源SIRT5促进FMDV-O复制的机制提供参考依据。

摘要：经济发展新形势下,广播电视行业市场化改革全面推进,资本建设取得了显著成效。广播电视行业作为公共服务机构之一,它可以通过广告、传输网络、音视频制作等方式获得一定的资金收入,通过资金流动、控股、兼并、交易等方式实现对资金的科学运营,从而实现内部资源的合理配置,促进自身经营效益提升。

摘要：MGF360-9L是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重要的毒力基因,本实验室前期使用免疫共沉淀和液相色谱-质谱(IP-MS)联合技术,明确了MGF360-9L和宿主蛋白自噬/苄氯素1调节因子1(autophagy/beclin-1 regulator 1,Ambra 1)具有相互作用,现有的研究已经证实宿主蛋白Ambra 1在病原感染中发挥重要作用。为明确Ambra 1介导MGF360-9L对ASFV复制的调控作用及其机制,本研究构建Ambra 1真核表达质粒,使用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)技术,验证了Ambra 1和MGF360-9L的互作及互作区域。设计并合成Ambra 1的RNA干扰(RNAi)序列,运用实时荧光定量PCR(real-time q PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)技术,证明了Ambra 1过表达抑制ASFV的复制,下调Ambra 1的表达则能够促进ASFV的复制。此外也证明了Ambra 1剂量依赖性降解MGF360-9L蛋白。总之,本研究明确了宿主蛋白Ambra 1介导ASFV MGF360-9L抑制其复制的初步机制。该研究丰富了ASFV蛋白与宿主蛋白之间的互作调控网络,为进一步研究ASFV-宿主相互作用积累了数据。