摘要：为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。

摘要：为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。

摘要：为实现牛结节性皮肤病病毒(LSDV)和羊痘病毒属(CaPV)其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和CaPV其他成员的双重荧光定量PCR检测方法。结果显示:本方法可以特异性扩增LSDV和CaPV其他成员,并且与其他牛、羊病毒无交叉反应,特异性好;对pLSDV-010和pCaPV-068质粒标准品的最低检测限均为15 copies/μL,具有较高的灵敏性;组内和组间变异系数均小于1.75%,重复性良好。应用本试验建立的方法与荧光定量PCR方法同时检测542份临床样品,发现CaPV的样品符合率为98.52%,LSDV为99.63%。本试验建立的方法为CaPV鉴别筛查、LSDV精准防控及流行病学调查提供了快捷有效的技术手段。

摘要：根据山羊Toll样受体（TLR2、TLR4和TLR9）及管家基因β-actin的保守序列设计特异性引物,分别建立不同的荧光定量PCR标准曲线及直线回归方程,并对方法的灵敏度、重复性和特异性进行检验。结果表明：山羊TLR2、TLR4、TLR9及管家基因β-actin的荧光定量RT-PCR标准曲线相关性R2大于0.984;特异性强,出现特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的方法对N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒（△N1L株）感染山羊外周血淋巴细胞TLR2和TLR9 mRNA表达水平进行了检测,△N1L株可以显著提高机体固有免疫应答水平。本研究建立的山羊天然免疫因子相关受体荧光定量PCR方法可应用于山羊痘新型基因工程疫苗的评价。

摘要：为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。

摘要：为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。

摘要：目的在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立。结果山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γmRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P>0.5)。结论本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础。

摘要：根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。

摘要：根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3%。本试验成功扩增1株2000bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5。将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%~100.0%,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高。应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood(ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远。结果表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。

摘要：为了了解广西地区竹鼠细小病毒的分子生物学特性与遗传变异情况,通过PCR、序列比对分析等方法,对采集到的某竹鼠场腹泻病料进行病原学检查。结果表明,用设计的引物A1/A2从竹鼠血清、内脏中检测到2株竹鼠细小病毒,将其分别命名为1-XQ、3-ZQ。用软件分析,1-XQ、3-ZQ核苷酸同源性为99.9%;与另外2株广西竹鼠细小病毒分离株的核苷酸同源性分别为96.8%~97.5%和96.9%~97.6%;与蝙蝠细小病毒的同源性较高,为98.9%~99.0%;与老鼠细小病毒的同源性为87.3%~87.6%;与牛、鹅、番鸭以及人类等其他种类细小病毒核苷酸同源性较低,为31.8%~41.6%。说明1-XQ、3-ZQ与广西竹鼠分离毒株、中国分离到的蝙蝠毒株亲缘关系最近,属于同一分支。