摘要：为制备诺如病毒(Norovirus,NoV)P颗粒嵌合猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)S1基因多表位的抗原.本研究通过设计合成PEDV S1多表位基因序列,酶切后连接到诺如病毒P基因重组pGEX-4T-1载体,将载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,提取质粒进行双酶切验证和测序.将测序正确的重组质粒转化至BL21表达菌体,使用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)在不同诱导时间下进行原核表达,确定最佳诱导条件,并对重组蛋白进行可溶性分析.使用鼠源谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)单抗和PEDV阳性血清通过蛋白免疫印迹试验检测纯化后的重组蛋白.重组质粒NoV P-partical-PEDV-SE经双酶切鉴定获得大小约510 bp的目的基因条带,进一步测序结果证明重组质粒构建成功.诱导表达的重组蛋白分子质量约为79 ku,与预期大小一致.使用1.0 mmol/L IPTG在37℃条件下培养2 h作为最佳诱导条件,对超声破碎后的菌体进行检测,试验结果显示重组蛋白可在上清液中表达.鼠源GST单抗与PEDV阳性血清均能特异性地识别纯化后的重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.本研究通过对NoV P-partical-PEDV-SE蛋白原核表达及纯化,成功获得大量纯度较高的重组蛋白,为进一步制备猪流行性腹泻多表位口服疫苗,实现对PEDV的有效预防奠定基础.

摘要：本研究拟建立一种能在基层实时、便捷诊断鹅新城疫病毒(goose Newcastle disease virus,GNDV)的检测方法。根据GenBank中公布的GNDVF基因的高度同源保守序列设计特异性引物,并在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂,建立可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,建立的方法能特异地检测出GNDV及NDV Lasota疫苗株,而小鹅瘟病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等其他病毒均为阴性。所建立的GNDV可视化RT-LAMP检测方法对RNA的最低检测限为10pg,反应过程不需PCR仪等复杂的仪器,50min即可完成反应,可经肉眼观察反应体系颜色判定结果。该方法特异性强、灵敏度高,且操作安全、简便、快捷,可满足基层筛查GNDV的需求。

摘要：为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。