摘要：目的:研究组织因子抑制物2(TFPI-2)基因在维吾尔族妇女宫颈病变组织中的甲基化水平,探讨其甲基化水平变化与宫颈病变的关系。方法:收集维吾尔族妇女慢性宫颈炎、宫颈内瘤变(CIN、cervical intraepithelial neoplasia)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)患者的新鲜组织标本,提取高质量基因组DNA和RNA,设计TFPI-2基因启动子区CpG岛片段特异性PCR引物及RT-PCR引物,应用Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析平台和半定量RT-PCR技术,对维吾尔族妇女宫颈组织DNA进行甲基化水平定量分析。结果:分析Sequenom MassArray质谱数据,TFPI-2基因启动子区CpG岛片段(目的片段)甲基化水平定量差异显著(P<0.05)。分别对TFPI-2的单点CpG位点甲基化水平差异进行分析,可见TFPI-2基因的目的片段的CpG-1、CpG-6、CpG-7、CpG-8、CpG-9和CpG-11等六个CpG位点甲基化率在肿瘤与正常对照之间均有统计学差异(P<0.05)并且两个CpG位点相关性很密切(r<0.5、P<0.01);半定量RT-PCR鉴定结果表明,TFPI-2 mRNA表达水平在宫颈炎组增高,在CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ组降低,而在宫颈鳞癌组最低,宫颈炎组与宫颈癌组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),说明该基因转录表达水平下调伴随着宫颈病变进程。结论:维吾尔族宫颈癌细胞内的TFPI-2基因启动子区CpG岛高甲基化与该基因表达水平变化密切关联。在维吾尔族妇女宫颈病变进程中TFPI-2基因启动子高甲基化是其基因的转录水平(mRNA)下调的重要原因,可能是宫颈癌的早期预警指标,为该基因甲基化相关的表观遗传学研究提供了依据。

摘要：目的:比较现有的DNA制备方法,建立一种从甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraf-fin-embedded tissues,FFPET)提取高质量基因组DNA的方法。方法:将传统基因组DNA提取方法与市场供应的DNA亲和层析柱结合在一起,以水浴脱腊法替代二甲苯脱腊法,设计一种改良的基因组DNA快速提取方法,从石蜡包埋宫颈癌组织标本提取基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳法和聚合酶链式反应法进行鉴定。结果:改良的基因组DNA提取法整合了水浴脱蜡与DNA亲和层析柱的优点,从石蜡包埋宫颈癌组织中获得了高质量的基因组DNA,特别是能以很高的效率回收大于20 kb的基因组DNA大片段。结论:改良的基因组DNA提取方法简单快捷,是一种从石蜡包埋组织中回收高质量基因组DNA的有效途径。

摘要：背景:以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。目的:构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。方法:实验组:设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组:设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。结果与结论:转染48h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。

摘要：目的探讨维吾尔族妇女宫颈病变及其人乳头状瘤病毒（humanpa pillomavirus，HPV）感染与低相对分子质量蛋白酶体（low molecular-weight protein，LMP）基因启动子区甲基化水平的关系和意义。方法利用专业软件设计LMP2和LMP7基因启动子区含CpG岛特异性PCR引物，对SiHa宫颈癌细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序，确定该区域所含CpG序列甲基化情况；收集维吾尔族妇女正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）患者新鲜组织和石蜡组织标本78例，并提取DNA，采用Sequenom MassARRAYDNA技术平台（质谱分析），定量分析LMP2和LMP7基因启动子甲基化水平，同时以HPV分型芯片鉴定HPV亚型，分析基因甲基化与HPV感染的关系；应用RT—PCR和免疫组织化学方法检测LMP2、LMP7mRNA和蛋白的表达，并分析蛋白表达与基因甲基化的关系。结果LMP2和LMP7基因相应目的片段各含有22个CpG位点，在SiHa宫颈癌细胞基因组DNA中，只有LMP7有2个位点发生甲基化。宫颈病变病理过程伴随着LMP7基因CpG片段甲基化水平改变，其在CSCC和CIN组织的甲基化率（0．1864±0．0893和0．0728±0．0548）高于正常宫颈上皮组织（0．0652±0．0488），差异有统计学意义（P〈0．05）。随着宫颈病变的加重LMP7mRNA和蛋白表达逐渐下调，各组间表达差异具有统计学意义（P〈0．05），LMP7蛋白表达随着该基因甲基化率增高而降低（F=8．69，P=0．035）。而LMP2蛋白表达在3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。HPV分型芯片检出12种HPV基因型，其中HPV16感染率构成比为52／78（66．7％），HPV16亚型阳性与宫颈病变进程及LMP7基因甲基化率升高趋势正相关（t=1．996，P=0．049）。结论LMP7基因启动子区CpG岛甲基化是一种宫颈癌病变特异性改变，与HPV16感染可能存在密切关系。

摘要：目的探讨维吾尔族妇女宫颈病变及人乳头状瘤病毒（HPV）感染与抗原处理相关转运体（TAP）基因启动子区甲基化水平的关系和意义。方法利用专业软件设计TAP1和TAP2基因启动子区含CpG岛特异性PCR引物，对宫颈癌SiHa细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序，确定该区域所含CpG序列的甲基化情况。收集维吾尔族妇女15例正常宫颈上皮、30例宫颈鳞状上皮内肿瘤形成（CIN）和33例宫颈鳞癌患者的新鲜组织标本共78例，提取DNA，采用MassArrayDNA技术平台（质谱分析）定量分析TAP1和TAP2基因启动子甲基化水平，同时以HPV分型芯片鉴定HPV亚型，分析基因甲基化与HPV感染的关系。结果（1）TAP1和TAP2基因相应目的片段各含23个和8个CpG位点，在宫颈癌SiHa细胞基因组DNA中，分别有5个和8个CpG位点发生甲基化。宫颈病变病理过程伴随着TAP1基因CpG片段甲基化水平的改变，其在宫颈鳞癌和CIN组织的甲基化率[（0．048±0．039）和（0．037±0．026）]高于正常宫颈上皮组织（0．035±0．029），差异有统计学意义（P〈0．05）。尽管TAP2基因甲基化水平也发生了相应改变，但其差异无统计学意义（P〉0．05）。HPV分型芯片检出13种HPV基因型，其中HPV16所占比率为66．7％（52／78），HPV16亚型阳性与宫颈病变进程及TAP1基因甲基化率的升高趋势呈正相关（X^2=6．08，P=0．039）。结论TAP1基因启动子区CpG岛甲基化是宫颈癌病变的一种特异性改变，与HPV16感染可能存在密切关系。

摘要：目的 探讨宫颈上皮内瘤变和宫颈癌与内质网蛋白57（ERp57）基因启动子区甲基化水平的关系和意义。方法应用MethPrimers软件设计ERp57基因启动子区CpG岛特异性PCR引物，对宫颈癌SiHa细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序，确定目的片段所含CpG序列甲基化情况。收集15例正常宫颈上皮（对照组）、30例宫颈上皮内瘤变（CIN组）和33例宫颈鳞癌（CSCC组）患者的新鲜组织标本，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF）技术定量分析宫颈病变组织DNAERp57基因启动子单-CpG位点的甲基化水平。结果ERp57基因相应目的片段各含9个CpG位点，在宫颈癌SiHa细胞基因组DNA中，所有的CpG位点都发生了甲基化，甲基化率为100％。MALDI—TOF检测结果显示，在CSCC组中，CpG-1、CpG_5和CpG．_7位点的甲基化水平分别为0．9021±0．1810、0．85214-0．1696和0．9671±0．1425，对照组分别为0．7721±0．0644、0．7347±0．0924和0．8765±0．0226，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。CSCC组、CIN组和对照组宫颈组织ERp57基因的甲基化水平分别为0．9065±0．3709、0．8697±0．3336和0．8040±0．4705，差异无统计学意义（P=0．052）。结论维吾尔族妇女宫颈病变组织中，ERp57基因启动子某些单个CpG位点发生甲基化后，引起该基因转录下调，其位点可能是关键性CpG位点。