摘要：背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。目的:观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。设计、时间及地点:单一样本观察的细胞基因工程实验,于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料:5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。方法:采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后,采用Lipofectamine2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。主要观察指标:倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因,基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上,构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞,24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中,说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。

摘要：背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。设计：单一样本观察。单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。材料：实验于2006—03／2007—06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2．0～2．5kg。方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24h后，在倒置荧光显微镜488am蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。

摘要：背景：研究表明神经干细胞在脊髓损伤中具有潜在的治疗作用，但何时移植效果较好？目的：观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用，并分析其移植时效性。设计：观察对比实验。单位：大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室。方法：实验于2003-07／08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成。①取孕14～16d的大白鼠1只，引颈处死，剖腹，取出胎鼠，钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织，体外培养大鼠胚胎神经干细胞。②将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组，即损伤对照组、早期移植组和延期移植组，每组10只。3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型，造成大鼠下肢瘫痪，早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞。观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况。神经干细胞移植4周后，取出移植区脊髓，作切片进行免疫组织化学染色，观察比较各组大鼠的脊髓组织形态学变化。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。主要观察指标：①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况。②神经干细胞移植4周后各组大鼠脊髓移植区的组织形态学变化。结果：脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只，全部进入结果分析，无脱失。①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况：早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善，但早期移植组表现尤为显著。早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复，两三周后可出现爬行，4周后后肢活动活跃：损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复。②移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化：脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填，镜下有大量新生的细胞，表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色。损伤对照组肉眼见两断端间呈空腔状，镜下脊髓残端变性坏死明显，空泡变性等。延期移植组脊髓移植区的组织形态学变化介于早期移植组和损伤对照组之间，无典型的组织形态学变化特征，镜下有一定量的新生细胞，但数量较早期移植组明显少。结论：同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用，早期移植疗效更好。