摘要：为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

摘要：[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。

摘要：旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5′非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果:Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5′UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P<0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P<0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。

摘要：为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

摘要：为了建立一种基于牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)囊膜蛋白E0基因的实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GenBank数据库中BVDV E0基因序列设计特异性引物,扩增BVDV新疆塔城分离株TC株的E0基因并克隆至pBM23载体中并测序鉴定;根据测序结果对E0基因的基本理化性质、B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行生物信息学分析;以pBM23-E0为标准质粒,10倍梯度稀释后建立实时荧光定量PCR标准曲线。结果表明:BVDV TC株E0基因长度为681 bp,与已发表的BVDV1 V070株E0基因氨基酸同源性为97.36%;生物信息学分析表明,E0蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白有4个O-糖基化位点和19个磷酸化位点,11个潜在的B细胞抗原表位。二级结构以无规则卷曲为主,并用SWISS-MODEL构建出E0蛋白的三级结构;成功绘制出检测BVDV TC株E0基因荧光定量PCR的标准曲线,相关系数(R^2)>0.9980。说明成功建立了基于BVDV E0基因的实时定量PCR的检测方法。

摘要：为了构建牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)囊膜蛋白E2基因高可变区(hyper variable region,HVR)缺失型核酸疫苗,为BVDV防控提供新的方法,试验依据GenBank中BVDV基因组序列设计引物,以BVDV新疆分离株TC cDNA为模板,扩增E2基因并测序,使用生物信息学软件分析E2蛋白的跨膜区和HVR区域等;采用常规PCR和搭桥PCR等方法扩增E2基因的不同缺失型HVR区域,并将其插入到真核表达载体pVAX1中,构建成真核表达质粒;分别于0,2,4周时免疫Balb/c小鼠,并在首次免疫后0,14,28,42天采集血清,通过ELISA法测定IgG水平。结果表明:成功扩增出BVDV TC株E2基因,大小为1122 bp;E2基因与BVDV 1b毒株HP-KY-PK13(登录号KT355592.1)及BVDV 1b毒株3156(登录号JN704144.1)的E2基因具有较高的同源性,E2 HVR1区域位于E2基因N端,HVR2区域位于E2基因中间部位;成功构建了E2基因不同的HVR缺失型真核表达质粒pVAX1-E2 HVR1△1-20、△1-64、△21-40、△41-64和pVAX1-E2 HVR2△140-216;与免疫pVAX1相比,E2基因不同HVR缺失质粒及野生型E2质粒诱导的IgG抗体水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);而在首次免疫42天时,用pVAX1-E2 HVR1△41-64免疫诱导的IgG抗体水平最高,约为pVAX1-E2的3.9倍。说明用pVAX1-E2 HVR1△41-64制备的核酸疫苗能诱导动物产生较高水平的IgG。

摘要：为了研究紧密连接蛋白Occludin(OCLN)在调控牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)胞内复制中的重要作用。使用Benchling平台设计OCLN的向导RNA(short guide RNA,sgRNA)序列,克隆至LentiCRISPR V2质粒中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(madin-darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,使用Western blot检测OCLN敲除情况,建立OCLN敲除MDBK细胞系;于BVDV感染OCLN KO细胞不同时间,使用荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)检测BVDV 5’非编码区(untranslated region,UTR)mRNA和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)水平;使用Reed-Muench法测定BVDV感染OCLN KO细胞不同时间后病毒滴度;使用倒置显微镜观察BVDV感染OCLN KO和MDBK细胞不同时间后致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)情况;使用qRT-PCR检测OCLN KO细胞中BVDV吸附和内化情况。结果发现,与Scramble处理组相比,OCLN KO细胞中OCLN蛋白表达显著性降低,BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA水平显著性降低,BVDV滴度显著性降低,BVDV感染造成的细胞CPE明显减弱,BVDV吸附和内化作用明显减弱。表明OCLN敲除后显著性抑制BVDV通过吸附和内化作用进入MDBK细胞,将为抗BVDV的新方法和技术建立提供依据和重要靶点。

摘要：前期研究发现高表达miR-29b能显著抑制牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)在体外的复制,而miR-29b过表达是否影响BVDV在体内的复制尚未见有报道。研究设计扩增牛pre-miR-29b基因片段的引物,以MDBK基因组为模板,PCR扩增pre-miR-29b并克隆至慢病毒载体pLL3.7。将阳性质粒pLL3.7-pre-miR-29b与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度,同时包装pLL3.7空质粒的慢病毒作为阴性对照。将4~5周龄BALB/c小鼠随机分成5组,每组6只,连续2次尾静脉注射2.5×107 IU慢病毒悬液pLL3.7-pre-miR-29b或pLL3.7,并于慢病毒注射后96 h通过滴鼻途径攻毒BVDV毒株NADL(1.68×105 TICD50/只),于攻毒后不同时间(0,2,4,10,15 d)处死BALB/c小鼠,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和血液,提取总RNA,使用荧光定量RT-PCR检测不同组织中BVDV拷贝数;同时制备病理组织切片观察各组织病变情况。结果显示,成功构建pLL3.7-pre-miR-29b质粒;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b和pLL3.7慢病毒;使用荧光定量RT-PCR检测发现,pLL3.7-pre-miR-29b感染能显著性降低BVDV拷贝数;与pLL3.7-pre-miR-29b感染的处理组相比较,pLL3.7感染的对照组中各组织病变情况较为严重。结果表明,BALB/c小鼠体内过表达miR-29b能明显抑制BVDV的复制,减轻BVDV感染造成的病变,为以后研发抗BVDV的有效策略和方法提供了理论依据。