摘要：【背景】近年来,珊瑚白化事件频有发生,面临着严重衰退。由气候变化引起的珊瑚病原菌快速增殖是导致珊瑚白化的主要因素之一。施罗氏弧菌是枇杷珊瑚的致病菌,能侵入珊瑚虫体内而使珊瑚白化死亡。【目的】优化并建立一种钙黄绿素显色法快速检测珊瑚致病菌施罗氏弧菌的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplificaiton,LAMP)检测技术。【方法】以枇杷珊瑚致病菌施罗氏弧菌为研究对象,针对施罗氏弧菌的rpoD (RNA polymerase subunit D)基因设计6条特异性扩增引物,建立LAMP检测体系并检测其特异性和灵敏度,同时对LAMP法、常规PCR和荧光定量PCR3种检测方法进行比较分析。【结果】供检测的10个样品菌株中,施罗氏弧菌反应结果为阳性,呈亮绿色,其他9株包括阴性对照(灭菌水为模板)反应结果为阴性,呈浅橙黄色;同时,所建立的钙黄绿素-LAMP方法最低检测限度为3.641×10~3 cps/mL,具有与荧光定量PCR等同的灵敏度和准确性,是常规PCR最低检测限度的0.1%;此外,通过模拟野外海水样品检测发现,钙黄绿素-LAMP方法对海水样品中施罗氏弧菌的检测限度可达1.3×10~2 CFU/mL。【结论】建立的钙黄绿素-LAMP检测技术具有很好的特异性、灵敏度和准确性,其操作方法简单、方便,无需昂贵仪器,适用于野外现场珊瑚致病菌施罗氏弧菌的快速检测。

摘要：长棘海星(Acanthaster planci)的暴发是导致我国南海乃至印度—太平洋海域珊瑚礁退化的主要原因之一。浮游幼体的密度是决定成体种群是否暴发的重要指标,但是由于幼体肉眼不可见且不易分辨,常规调查和显微镜观察均无法有效检测到自然海域的长棘海星幼体,因此迫切需要开发一种高灵敏性且特异性的长棘海星幼体检测技术。本研究针对长棘海星幼体线粒体细胞色素氧化酶亚基I(mt COI,mitochondrial cytochrome oxidase subunit I)基因序列,建立了基于聚合酶链式反应(PCR,polymerase chain reaction)的长棘海星幼体特异性检测技术,并对西沙七连屿珊瑚礁海域的长棘海星幼体进行了检测。结果表明,设计筛选的4对特异性引物均可以扩增长棘海星Apmt COI基因片段,且与蓝指海星(Linckia laevigata)、面包海星(Culcita novaeguineae)、粒皮海星(Choriaster granulatus)和吕宋棘海星(Echinaster luzonicus)没有交叉反应。在退火温度为58.5℃时,引物2aooni F/2aooni R的特异性最佳,具有较高的灵敏度,可检测到皮克级的长棘海星基因组DNA。利用该技术检测了西沙七连屿海域长棘海星幼体分布情况,发现10月底西沙七连屿珊瑚礁海域能检测到长棘海星幼体,且幼体分布并不均匀。因此,该检测技术可作为今后长棘海星幼体种群监测的有效方法。