摘要：目的:评估1种应用实时荧光PCR法检测念珠菌(包括白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌)核酸试剂的性能是否满足临床应用要求。方法:(1)应用含白色念珠菌10^(6)和10^(8)CFU/mL 2种浓度水平的临床混合下呼吸道样本,按照EP15-A3文件5×5精密度设计方案,5 d内每天每种浓度做5个复孔,共计25孔,提取核酸后应用该试剂扩增以评价其重复性和实验室内精密度;(2)应用白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌3种念珠菌标准株及大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌标准株菌液,提取核酸后应用该试剂扩增以评价其特异性;(3)将白色念珠菌标准株用生理盐水10倍梯度稀释为1×10^(5)、1×10^(4)、1×10^(3)和1×10^(2)CFU/mL,5 d内每天每种浓度4个复孔,共计20个复孔,提取核酸后应用该试剂扩增以评价其检出限;(4)收集101例来自呼吸系统疾病患者的下呼吸道标本,提取核酸后应用该试剂扩增检测,并与真菌培养法的结果进行比较,以评价其符合率。结果:(1)该试剂检测含白色念珠菌10^(8)CFU/mL和10^(6)CFU/mL的临床混合样本的重复性精密度分别为2.18%和1.32%,实验室内精密度分别为2.18%和1.36%;(2)该试剂检测白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌标准株的结果均为阳性,检测大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌标准株的结果均为阴性,无交叉反应;(3)该试剂检测1×10^(5)、1×10^(4)、1×10^(3)和1×10^(2)CFU/mL的白色念珠菌标准株的检出率分别100.00%(20/20)、100.00%(20/20)、65.00%(13/20)和25.00%(5/20),检出限为5.8×10^(3)(95%CI 2.3×10^(3)~4.3×10^(4))CFU/mL;(4)101例下呼吸道标本,该试剂检出的阳性率为79.21%(80/101),真菌培养法的阳性率为58.42%(59/101),2者间差异有统计学意义(P<0.05);2种方法检测结果一致性中等(Κappa=0.5388),阳性符合率为100.00%(59/59),阴性符合率为50.00%(21/42)。结论:该试剂的精密度高、特异性好,与真菌培养的一致性中等,能基本满足临床应用要求。

摘要：目的克隆人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因cDNA,构建其真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,并转染16HBE细胞。方法根据GeneBank中人TIM-4 cDNA序列(编号:NM-138379.2),设计出带有EcoRI和BamHI的上下游引物,应用RT-PCR技术,从人骨髓中扩增出TIM-4基因编码区序列,克隆到pMD18-T载体,形成pMD18-T-TIM-4重组质粒,经菌落PCR,双酶切,测序鉴定获得人TIM-4基因cDNA片段,然后将其亚克隆入pEGFP-C2绿色荧光载体中,并通过菌落PCR,双酶切,测序鉴定其重组体。将测序正确的pEGFP-C2-TIM-4质粒转染人气道上皮细胞(16HBE),用实时定量PCR检测目的基因的表达。结果成功扩增出人TIM-4 cDNA全长1134 bp,经T-A克隆构建的pMD18-T-TIM-4重组质粒经菌落PCR,双酶切,测序证实载体中含有正确的TIM-4编码区片段。由此构建的真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,经菌落PCR扩增出1134 bp左右的片段,经双酶切后产生4.7 kb和1134 bp左右的2条带,DNA测序显示与GeneBank中人TIM-4 cDNA序列一致。重组质粒转染16HBE细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,经实时定量PCR分析,转染细胞TIM-4基因的表达显著增加。结论首次从人骨髓中扩增出TIM-4基因cDNA全长,构建了其真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,并在16HBE细胞内成功高表达,为进一步研究TIM-4的生物学功能奠定了基础。

摘要：移动式核酸检测实验室对短时间内提高区域新型冠状病毒核酸检测能力起着极为重要的作用,是落实“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的基础和前提。本文总结了在大规模人群新型冠状病毒核酸筛查中应用移动式核酸检测实验室在流程设计、人员配备、生物安全等方面的经验以及工作中的重点注意事项,为今后局部疫情中应用移动式核酸检测实验室进行大规模人群新型冠状病毒核酸筛查提供参考。

摘要：目的:针对BMI-1基因的不同部位构建4种不同的BMI-1 shRNA真核表达载体,转染人宫颈癌细胞系Hela并筛选其有效序列。方法:应用DNA重组技术将针对人BMI-1基因的不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒psi RNA-hH1neo中,构建BMI-1 shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BMI-1 shRNA3和BMI-1 shRNA4,用阳离子脂质体介导转染Hela细胞以筛选其有效序列。结果:4个BMI-1 shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BM-1 shRNA3和BMI-1shRNA4经测序鉴定证明插入正确。②在Hela细胞中转染BMI-1 shRNA2和BMI-1 shRNA4能显著下调BMI-1mRNA表达,抑制率分别为59.9%和67.4%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BMI-1 shRNA3和BMI-1 shRNA4,其中BMI-1 shRNA2和BMI-1 shRNA4能有效地抑制BMI-1在Hela细胞中的表达。本工作为今后研究BMI-1在肿瘤基因治疗中奠定基础。

摘要：随着新课改的不断推进,高中化学教师在进行教学的时候更应当注重对于学生思维模式的构建,在化学习题课上设定更加明确的教学目标,尝试着鼓励学生深入思考多元化的解题方式,面对难题的时候积极寻求最便捷的解决办法.接下来,笔者将从三个方面简单介绍如何在高中化学习题课堂上进行更优质的教学设计.

摘要：目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法:依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果:POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同(直线斜率0.0171<0.1)。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3%和2.1%;TBP基因批内变异与批间变异分别为1.2%和2.6%。结论:建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析。

摘要：本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。