摘要：构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到***感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到***感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。

摘要：目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486,TDRG1-shRNA738,TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,使用Lipofectamine 2000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平。结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达。

摘要：目的：构建穿膜肽TAT与EGFP融合蛋白的原核表达系统，研究该融合蛋白对人成熟精子的穿膜作用和对精子运动参数的影响。方法以pEGFP-N1载体为模板，设计N端和C端含有TAT序列的引物，用PCR技术扩增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因，扩增产物插入载体 pET28a，构建成重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT。将重组质粒转入大肠杆菌DE3中，IPTG诱导TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后SDS-PAGE电泳鉴定。将融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分别加入正常人精子中孵育，荧光显微镜观察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情况。结果成功构建了高表达重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT，纯化了分子质量约为32 kD的融合蛋白 TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT对正常人成熟精子存活率及运动参数无明显影响。结论通过对融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表达纯化及活性分析，证实穿膜肽TAT在精子中的跨膜转运作用，为将来精子研究提供了实验基础。