摘要：[目的]探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)胆盐活化脂肪酶(EgBAL)的生物信息学特征并进行原核表达,检测EgBAL重组蛋白的免疫原性,为囊性棘球蚴病疫苗抗原筛选提供理论依据。[方法]从NCBI数据库获取细粒棘球绦虫EgBAL基因序列(GenBank登录号:HM748917),设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴cDNA为模板,通过PCR扩增并克隆EgBAL基因。使用Mega 7.0软件,通过邻接法(NJ)构建系统进化树,运用生物信息学软件对EgBAL蛋白理化性质和结构特征进行预测分析。构建含EgBAL基因重组pET-22b质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞诱导表达EgBAL重组蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并进行纯化。利用Western blotting分析重组蛋白的免疫原性。[结果]细粒棘球绦虫EgBAL基因片段大小为1 020 bp。系统进化树显示,EgBAL蛋白与中华树鼩EgBAL蛋白处于同一分支,进化距离较近,相似性高达99.60%。生物信息学分析显示,EgBAL基因全长1 014 bp,编码337个氨基酸,EgBAL蛋白分子质量为37 089.59 u,理论等电点为4.77,不稳定指数为44.72,为不稳定蛋白,脂肪系数为66.11,亲水性为-0.429,为亲水性蛋白,无跨膜区域及信号肽。EgBAL蛋白具有14个潜在B细胞抗原表位,二级结构包括α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲,分别占27.90%、12.76%、12.76%和56.08%。此外,EgBAL蛋白含有35个磷酸化位点,其中包括12个丝氨酸磷酸化位点、16个苏氨酸磷酸化位点和7个酪氨酸磷酸化位点。本研究成功构建重组pET-22b-EgBAL质粒,诱导表达得到EgBAL重组蛋白大小约38 ku。Western blotting结果显示,该重组蛋白可被细粒棘球绦虫感染的昆明小鼠和犬的阳性血清识别,具有良好的免疫原性。[结论]本研究成功克隆了细粒棘球绦虫EgBAL基因、表达了EgBAL重组蛋白,并初步证实重组EgBAL蛋白具有较好的免疫原性,提示其有作为囊型棘球蚴病疫苗或诊断候选抗原的潜力,为进一步研究EgBAL蛋白的功能提供了科学依据。

摘要：目的了解细粒棘球绦虫的乳酸脱氢酶蛋白基因的生物信息学特性,并进行原核表达。方法利用NCBI网站登录的细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因序列设计特异性引物和qRT-PCR引物,使用PCR扩增细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因,使用荧光定量法检测细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶在不同发育阶段的相对表达量,使用生物信息学软件对细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶蛋白进行分析;构建重组pET28a-EgLdh质粒,转进大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blot对蛋白进行免疫原性分析;利用原核表达重组pET28a-EgLDH蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析其在虫体上的分布。结果生物信息学分析发现EgLDH全长996 bp,编码331个氨基酸,分子式为C_(1575)H_(2561)N_(425)O_(470)S_(17),相对分子质量为35516.25,理论等电点为6.32,不稳定指数为27.96,显示为稳定蛋白,脂肪系数为106.83,亲水性为0.236,为疏水性蛋白,有13个潜在的B细胞抗原表位;通过双酶切鉴定及测序分析证明,pET28a-EgLDH重组质粒构建成功。重组质粒pET28a-EgLDH转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞后使用IPTG成功诱导表达蛋白,分子质量约为40 ku,Western blot结果显示,重组蛋白能被感染棘球蚴的犬阳性血清识别,表明其均具有良好的反应原性。EgLDH在细粒棘球绦虫阶段的相对转录水平显著高于原头蚴阶段。间接免疫荧光分析显示其定位在原头蚴的表皮层。结论rEgLDH具有较好的免疫活性,是一种潜在的疫苗候选抗原。

摘要：为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得Eg MDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板,用PCR扩增MDH基因全长序列;采用生物信息学软件对MDH蛋白的理化性质、结构特点等进行分析;构建重组质粒pET28a-MDH并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,随后纯化、复性蛋白,并通过Western-blot对蛋白进行抗原性分析;利用间接免疫荧光试验检测原头蚴中目的蛋白的定位;应用实时荧光定量PCR分析Eg MDH基因m RNA在原头蚴及成虫中的相对转录水平。生物信息学分析结果显示,Eg MDH基因长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子式为C1639H2599N445O475S16,相对分子质量为36 651.32,理论等电点为8.11,且编码蛋白没有信号肽和跨膜区,含有40个磷酸化位点,3个N连接型糖基化位点,9个优势B细胞抗原表位。二级结构由α-螺旋(46.69%)、无规则卷曲(31.93%)、延伸链结构(16.87%)和β-转角(4.52%)构成。克隆的基因长975 bp,预测分子质量为35.7 ku;Western-blotting显示,重组蛋白可以被抗His标签的家兔多克隆抗体和原头蚴可溶性全蛋白小鼠多克隆抗体识别;间接免疫荧光试验显示,Eg MDH蛋白定位在原头蚴的囊壁;实时荧光定量PCR显示,Eg MDH基因在成虫及原头蚴中均有表达,且原头蚴阶段的转录水平显著高于成虫(P<0.05)。本研究结果初步表明Eg MDH具有作为疫苗候选抗原的潜力,以期为后续细粒棘球绦虫疫苗研发提供候选抗原;同时也为后续细粒棘球绦虫MDH基因的深入研究奠定了基础。