摘要：根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌K88菌毛结构基因DNA序列 ,在其保守区用Goldkey软件设计了 1对引物 ,经PCR扩增从 2 0株野生分离株质粒中得到 17个大小在 815bp左右的阳性产物 ,经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析 ,确认所克隆的外源基因与报道的K88菌毛 (亚单位K88ab、K88ac、K88ad)蛋白结构基因序列一致 。

摘要：设计了 1对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养 ,然后挑菌做PCR ,同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果 ,从不同省 (市 )的送检病料中分离鉴定出 6 6株多杀性巴氏杆菌 ,PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合 ;该引物对其他 6种猪的常见呼吸道病原菌的扩增结果均为阴性 ;该PCR检测方法能检出CFU为 10 3/mL的巴氏杆菌模板。

摘要：利用已分离的菌株030224HB,根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物,用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH),扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp),并克隆到载体pMD18T(TVector),测序表明该基因相当保守。用pET28b构建了原核表达载体pET28bompH,转化BL21并诱导表达,SDSPAGE结果显示表达蛋白约为35ku,与报道大小相近。Westernblot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性,然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。

摘要：目的对人A组轮状病毒进行检测及分离鉴定,并研究其各基因片段的遗传进化关系。方法2019-2020年对湖北武汉市和襄阳市临床腹泻病人的粪便样品进行采集,共319份。设计特异性轮状病毒VP6基因引物,RT-PCR检测轮状病毒的感染情况。将阳性样品接种于MA104细胞进行轮状病毒的分离。RT-PCR特异性扩增VP6基因和特异性间接免疫荧光对其进行病毒鉴定及病毒增殖检测;并进一步通过RT-PCR扩增轮状病毒的11个基因片段,在线工具Rota C V2.0对测序结果进行分型分析。Mega软件对其全基因组序列进行遗传进化分析。结果轮状病毒感染阳性标本共69份,阳性率为21.63%。成功分离获得11株人轮状病毒,主要衣壳蛋白VP7和VP4基因型均为G9P[8]型。其中3株轮状病毒归属于类Wa株毒株,基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1。8株毒株在Wa-like的基因型中具有DS-1-like的NSP4为E2基因型特征。基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1。结论G9P[8]型人轮状病毒毒株在2019-2020年湖北部分地区占主导趋势,且其NSP4基因以E2基因型为主要流行形式。

摘要：根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计1对引物,PCR扩增LDH基因,首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上,然后连接到表达载体pGEX-KG上,经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在。将超声波破碎的诱导菌液高速离心,其上清用Glutathione Sepharose 4B bead亲和层析纯化。用猪肺炎支原体的标准阳性血清对纯化蛋白作Western-blot检测,出现目的条带;以纯化蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法,该方法具有较好的稳定性和重复性,较高的特异性与敏感性。用建立的ELISA方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试剂盒同时检测120份临床血清,二者总符合率为92.5%。用建立的ELISA方法检测了671份临床送检不同年龄阶段的猪血清,结果显示断奶前仔猪猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopnenmoniae,MHP)感染率为44.3%,保育猪为3.0%,育肥猪为17.44%,种猪为73.41%,这初步反映了猪喘气病在各个年龄阶段的感染率。

摘要：根据PRRSV已知序列设计两对引物,采用RT-PCR方法分别扩增orf7和orf5基因片段。利用EcoRI、SpeI和HindⅢ位点将orf7和orf5基因片段依次克隆到pMD-18T载体,构建成重组质粒pMD18NE,并比较所克隆基因序列的同源性。将串联的orf7和orf5基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建重组原核融合表达质粒pGEX-KGNE,并转化BL21,SDS-PAGE和Western-blot分析表明:orf7和orf5基因与GST获得了融合表达,并且表达的融合蛋白GST-NE具有免疫学反应活性,这为猪繁殖与呼吸综合征血清学诊断方法的建立及疫苗研究打下基础。

摘要：目前,禽流感检测方法较多,但均费时费力,且灵敏度不高。本研究立足于临床实际,选择A型流感病毒核蛋白(NP)基因序列保守区,设计了一对特异性引物,从临床病料中提取RNA,建立了一步法单管逆转录＿聚合酶链反应(RT＿PCR)快速诊断方法,该方法快速、灵敏,为RT＿PCR用于禽流感的临床早期确诊和分子流行病学调查奠定了基础。

摘要：参考GenBank中单核细胞增多性李斯特菌(LM)第I毒力岛(LIPI-1)有关基因序列设计引物,分段扩增、克隆了分离菌株XFL0605LIPI-1毒力岛全基因序列,序列全长8 558 bp,包括完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6个基因。对LIPI-1编码的6个毒力基因进行序列分析,各毒力基因反映的进化关系不尽一致,表明李斯特菌株在获得外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因来源也不尽相同。应用相应软件对各毒力基因编码蛋白的信号肽、跨膜区进行预测,确定了基因序列中调控蛋白PrfA结合区核苷酸序列。分析并确认了hlyA基因及推导氨基酸序列PEST基序和C端保守11肽序列。研究还发现LM菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105 bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有2个E/DFPPPPXD/E重复序列。

摘要：本研究从家猫组织中扩增并鉴定血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因,为阐明SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)感染家猫的机制提供理论依据.从家猫肺脏中提取总RNA,以Oligo dT-Adaptor为引物合成第一链cDNA,根据人及小鼠的ACE2基因mRNA序列设计系列引物,通过聚合酶链式反应,分段扩增出家猫ACE2基因的编码区的特异性片段并测序鉴定.家猫ACE2基因mRNA编码区共包括2 418个核苷酸,推测编码蛋白含805个氨基酸残基.其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠ACE2氨基酸序列的同源性分别达到85%,81%和81%.利用多种生物信息学工具软件对家猫ACE2蛋白的理化及生物学性质进行分析.比较人、家猫、果子狸、小鼠、大鼠等ACE2序列中与SARS-CoV结合有关的3个功能区,发现家猫ACE2与人ACE2的同源性最高,提示家猫ACE2在SARS病毒跨种感染中可能发挥重要作用.

摘要：EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12,分别克隆到以CMV启动子的siRNA表达载体pSilencer4.1-CMVneo中,构建相应的重组表达质粒p4.1-EP04、p4.1-EP08和p4.1-EP12。同时,将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中,按照读码框架与EGFP基因的5’端融合,获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4.1-EP04、p4.1-EP08、p4.1-EP12和阴性对照质粒p4.1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞,荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明,三个siRNA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达,抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04;在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论。这为深入研究EP0基因在PRV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础。