摘要：gM和gN是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒 (PRV)第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列 ,设计两对分别包含gM和gN完整编码区的特异性引物 ,以PRV国内地方分离株 (Ea株 )的细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.2kb和 0 .3kb的特异性片段。将扩增产物克隆到杆状病毒转座载体pFastBacl中 ,酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明 :Ea株gM、gN基因分别编码 394和 98个氨基酸 ,与Ka株的同源性分别为 98.4 %和 97.6 %。DNATool和DNASIS软件对gM、gN进行二级结构预测 ,发现gM存在 8个潜在跨膜区和一个N_糖基化位点 ,是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白 ;gN具有N_端信号肽序列、C_端跨膜区和潜在 0_糖基化位点 ,属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、gN的相互作用位点及二聚体的功能奠定了基础。

摘要：根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。

摘要：在推导和分析液压挖掘机工作装置运动轨迹和受力规律的基础上,开发了工作装置挖掘性能可视化软件,该软件可快速准确地描绘出工作装置挖掘范围,并且该软件绘制的挖掘力云图可直观描述挖掘机在某一区域的挖掘性能。为挖掘机工作装置的设计提供理论依据和实用手段,对于国内挖掘机生产厂家消化和吸收国外挖掘机产品的技术,提高国内挖掘机的设计水平,推动国内挖掘机行业的发展具有十分重要的意义。

摘要：因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的 ,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列 (GenBankL1 2 1 4 5)设计了一对特异性引物 ,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长 3 466bp的片段 ,然后将其克隆到pMD 1 8T中 ,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的 ;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET 2 8b后 ,转化BL2 1 (DE3) ,在IPTG诱导下获得高效表达 ,经Westernblotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板 ,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。

摘要：根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK- gE- LacZ+ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK- gE- gI- ORF1-ORF2 + ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK- gE- LacZ+ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。

摘要：从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。

摘要：针对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因保守区的核苷酸序列设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV野毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法。应用该方法检测猪常见病毒性病原(猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型),PRV gE基因缺失株,以及健康猪的组织,结果均为阴性,证明该方法特异性良好。该检测方法能够检到的阳性质粒模板最低浓度为254 copies/μL,最低病毒浓度为4.22 TCID50/100μL,比常规PCR敏感性高10倍;重复性试验结果表明该方法重复性良好;用TaqMan实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时检测37份临床样品,其中前者检出阳性病料22份,阳性检出率为59.64%,后者检出阳性病料15份,阳性检出率为40.54%,2种方法的符合率为81.08%。综上所述,该方法的建立为PRV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。

摘要：设计合成一对扩增猪Ⅱ型圆环病毒 (PCV 2 )全基因组的特异性引物 ,从 3份患断奶后仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)的死亡仔猪病料中 ,PCR扩增和克隆了 3株PCV 2全基因组序列。将所测序列与已公布的PCV毒株序列进行同源性比较 ,并绘制系统发育进化树。结果显示 ,所测毒株间的核苷酸同源性为 95 7%～ 99 4 % ,与其它毒株的同源性较高 ,达 95 1%以上 ;ORF1的核苷酸同源性高达 97 8%以上 ,氨基酸同源性大于 98% ;ORF2的核苷酸同源性较低 ,为 90 %～ 98%不等 ,推导的氨基酸序列同源性介于 87%～ 99 1%。进化树分析表明各分离毒株在进化上存在地域上的相关性。将克隆到的PCV 2基因组环化后 ,脂质体介导转染PK 15细胞 ,盲传 3代。间接免疫荧光检测表明 ,克隆到的基因组具有感染性。

摘要：根据GenBank中发表的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的核苷酸序列,设计3对特异性引物。通过PCR方法,以引物P1和P2从接毒细胞中扩增到猪型圆环病毒(PCV2)全基因组,克隆入pBluescriptⅡ SK(+)载体构建质粒SK-PCV2,以之为模板,用引物P5和P6扩增不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2);另一对引物P3、P4用于特异性扩增猪型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,与前面得到的SK-PCV2△ORF2基因连接,构建嵌合型质粒SK-PCV2-1,以此为基础构建双联体质粒SK-PCV2-1(DB)。体外转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测,结果表明本试验构建的嵌合病毒PCV2-1克隆具有感染性。

摘要：针对金黄色葡萄球菌sae基因前后两段序列设计两对引物,PCR扩增出sae基因上下游同源臂序列,克隆到穿梭载体pBT2中;两段序列之间用来自质粒p646的Em抗性基因片段连接,作为筛选标记,从而构建同源重组穿梭质粒pBT2Δsae;将pBT2Δsae电转化到金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,40℃经过七轮培养,进行抗性培养基筛选和PCR验证,以及RT-PCR观察基因表达水平。获得一株金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株RNΔsae,为进一步研究sae基因的调控机制等提供有用的实验材料。