摘要：本试验旨在建立一种可同时鉴别牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌的多重PCR方法。分别针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyaC—hyaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16S rRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因设计特异性引物,多重PCR的最佳扩增条件确定为:95℃10min预变性;95℃1min,56℃50s,72℃1min,循环30次;72℃10min延伸。结果表明,该多重PCR方法可同时扩增出以上三种致病菌的特异性片段,不能扩增出其他病原菌的相关片段;对多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和牛支原体的最低检测浓度分别为8×105CFU/mL、8×105CFU/mL和4×106CFU/mL。同时用该方法检测了牛支原体肺炎患牛的鼻拭子与肺组织,发现12h预增菌后,肺组织检测与牛支原体培养的阳性符合率为92%。对临床样本进行牛支原体分离培养需要3～4d时间,而采用多重PCR方法检测12h预增菌则能在24h内出结果。该多重PCR方法显著加快了临床诊断速度,具有推广应用价值。

摘要：以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸。将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应。根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础。

摘要：为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎 ,试验设计合成了 1对引物 ,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR方法。猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅰ型菌血清 2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段 ;大肠杆菌、猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株 ,有 11株为阳性 ,19株为阴性。结果证实 。

摘要：本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计并合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２），以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼脂糖凝胶电泳显示，从所有１１株野毒ＤＮＡ中都扩增出３７２ｂｐ和５２６ｂｐ两个片段，而Ｂａｒｔｈａ－ｋ６１只扩增出３７２ｐｂ一个片段。酶切分析证明ＰＣＲ产物是特异性的。ｇＢ基因是ＰｒＶ主要保护性抗原基因，是病毒复制必需的，强弱毒都有此基因；Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株是ｇＥ基因缺失的弱毒。所以，本实验建立的方法通过１次ＰＣＲ即可有效鉴别疫苗毒与野毒。这一方法将在今后根除伪狂犬病计划中发挥重要作用。

摘要：根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与 PRV 的 gB、gD、gE 基因序列互补的3对引物。对样品中的 PRV DNA 模板进行了多重 PCR 扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带。