摘要：为了构建能同时独立表达双基因的重组伪狂犬病毒通用转移载体,试验采用前期构建的p UC19-g E/HEK为骨架,将设计合成的独立表达双基因的表达盒(p CMV+MCS1+p CMV+MCS2+BGH p A)克隆至其XbaⅠ位点,获得通用转移载体pg E-CMV2,以多克隆位点限制性内切酶单酶切,并将EGFP基因克隆至MCS1的SpeⅠ/PstⅠ位点、DsRed基因克隆至MCS2的KpnⅠ/XhoⅠ位点,转化BHK-21细胞同时观察荧光。结果表明:多克隆位点限制性内切酶单酶切pg E-CMV2呈现单一条带,EGFP和DsRed均呈现目标荧光,且将两种荧光蛋白分别克隆至同一分子的MCS1与MCS2,两种荧光蛋白均能有效表达。说明pg E-CMV2构建正确,且能独立有效表达双基因,可用于实现将两个或多个外源基因一次重组入PRV基因组中,实现"一针多防"。

摘要：根据鸭疫里默氏杆菌(RA)16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,2株RA均呈阳性,而3株非RA均呈阴性。试验结果表明,该方法具有良好的特异性,该方法的表达式Ct=-3.676×lg copies+45.17,相关系数r2=0.996,R循环效率Eff(%)=93.482,DNA拷贝数在100～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品的最低检测限为1.0×101 copies/μL,重复性检测的变异系数低于5%,利用该方法分别对自然感染表现典型鸭疫里默氏杆菌病临床症状和病理变化的死亡雏鸭肝、心、脑组织等不同脏器进行细菌定量检测,阳性率均为100%,而用普通PCR检测阳性率分别只有72%(18/25)、84%(21/25)和92%(23/25)。证实本研究所建立的荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用于RA感染的快速诊断、流行病学调查以及鸭产品的检疫。

摘要：本试验采集广东某鸡场疑似禽网状内皮组织增生症患病鸡病料并进行处理,经接种DF1细胞、聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离鉴定出1株禽网状内皮组织增生症病毒(REV),命名为GD1210。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8443bp。将该分离株的基因序列与国内外各参考株相应序列进行同源性比对分析,与SNV株亲缘关系最近,核苷酸同源性最高。将该分离株感染1日龄SPF鸡以鉴定其致病性,结果显示该分离株使SPF鸡产生严重的免疫抑制作用。

摘要：根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株序列,选择5’NTR保守区域设计1对特异性引物和1条Taqman探针,通过矩阵法筛选引物探针的最佳浓度,建立了检测BVDV的荧光RT-PCR方法。结果显示,用1.5μL上下游引物混合液(10μmol/L)和0.5μL探针溶液(10μmol/L)对BVDV进行检测,可获得较小Ct值、较高吸光值,并可降低检测成本。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。将该方法应用在疫苗生产中,可快速准确地筛选出合格的原辅材料和半成品,为生产提供及时准确可靠的数据。

摘要：以伪狂犬病毒为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。根据已发表的伪狂犬病毒(PRV)Ra株TK基因序列设计2对引物,用PCR方法得到同源左右臂,克隆入PUC19载体中。利用平末端连接的方法将绿色荧光蛋白(EGFP)的基因表达盒插入到缺失位点,并在下游引入1个多克隆位点,构建缺失通用转移载体PUC19TK-EGFP。用脂质体转染试剂盒将PUC19TK-EGFP和PRV-Ra株的基因组共转染BHK细胞,以EGFP为标记基因,用噬斑法得到纯化的重组病毒,命名为TK/EGFP,为研制以伪狂犬病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。

摘要：根据NCBI GenBank 上登载的猪干扰素β基因序列(S41178),设计一对引物,直接从猪肝脏提取基因组DNA,经PCR 扩增及扩增产物的克隆、测序,获得了新兴本地猪干扰素β全基因片段,其大小为561 bp,与NCBI GenBank上登载的猪干扰素β基因序列完全一致,为进一步研究和开发猪基因工程干扰素制剂奠定了基础。

摘要：根据GenBank中的鸭疫里默氏杆菌（RA）1-19型16 S rRNA基因序列,分别与大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的16 S rRNA基因序列对比,设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16 SrRNA的PCR检测方法。结果表明,用该方法对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌进行检测,只有鸭疫里默氏杆菌的DNA能扩增出680 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;测序结果与GenBank中鸭疫里默氏杆菌相应序列完全一致;同时分别将鸭疫里默氏杆菌基因组DNA和菌液10倍稀释进行PCR扩增,对鸭疫里默氏杆菌DNA的最小检出量为1.907×10^-5g/L,对鸭疫里默氏杆菌菌液的最小检出量为1.5×10^4CFU/mL。证实,建立的基于鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA的PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。

摘要：为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。

摘要：根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。

摘要：参照GenBank发表的GPVB株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出GPVS1株NS2基因,目的片段长约1.4kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明:GPVS1株NS2基因全长1356bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的GPVB株相比核苷酸序列同源性为98.89%,推导氨基酸序列同源性为98.89%。