摘要：为摆脱限制性酶切位点不足的限制,构建可灵活改变多基因融合方向的表达载体,基于IIS型和IIT型限制性内切酶LguⅠ和BbvCⅠ设计开发了LB克隆系统。该克隆系统是以广宿主质粒pBBR1MCS-3为初始载体,利用PCR的方法,在其多克隆位点区插入LB片段(GCTCTTCCTCAGC)构建得到的。LB片段含LguⅠ和BbvCⅠ部分重叠识别位点,经这两种限制性内切酶酶切后可以产生相同非回文序列,利用这一性质可快速、灵活地将多个基因逐步、定向插入表达载体。为验证该克隆系统的有效性,将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)WG中两个糖基转移酶基因welB、welK逐步定向融合至LB克隆载体,并将重组质粒转入鞘氨醇单胞菌中表达。结果表明,基因融合表达对鞘氨醇胶产量影响较小,但是,对鞘氨醇胶粘度有重要影响。在发酵84 h时,重组菌株Sphingomonas ***/pBBR1MCS-3-LB-welKB的发酵液粘度较野生株提高约24.7%,粘度提升将有助于该鞘氨醇胶在石油开采、食品等多个领域的应用。综上所述,以鞘氨醇单胞菌为研究对象,验证了LB克隆系统在多基因融合中的应用,为构建融合酶提供了一种高效的方法。