摘要：目的建立血浆虫草素及代谢物3’-脱氧肌苷(3′-Deo)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法,研究其在大鼠体内的药动学。方法以2-氯腺苷(2-Chl)为内标,甲醇沉淀蛋白,色谱柱为Kinetex C18(3 mm×100 mm,2.6μm),流动相为水(5 mmol·L^(-1)乙酸铵)-甲醇溶液,梯度洗脱。电喷雾离子源,正离子多反应监测。研究大鼠灌胃虫草素(10 mg·kg^(-1))后血浆虫草素及3′-Deo药动学。结果虫草素和3′-Deo分别在0.5~100和1~200 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好,定量下限分别为0.5和1 ng·mL^(-1)。大鼠灌胃虫草素后,血浆虫草素浓度较低,主要转化为3′-Deo。虫草素和3′-Deo的峰浓度(C_(max))分别为(5.4±3.4)和(142.0±50.0)ng·mL^(-1),血药浓度-时间曲线下面积(AUC_(0-360 min))分别为(658.4±459.3)和(18034.9±4981.1)ng·min·mL^(-1)。结论该方法简单、灵敏、准确,适用于虫草素与3′-Deo血药浓度测定及药动学研究。

摘要：目的建立检测人组织因子（flTF）及其剪切体（asTF）的实时荧光定量PCR检测技术。方法分别采用文献报导及自行设计的检测人flTF和asTF的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测人flTF和asTF基因。将扩增的人flTF和asTF的基因片段纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含flTF和asTF基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测flTF和asTF基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物分别经测序证实为flTF和asTF的特异性片段。本法检测flTF和asTF基因表达的灵敏度均为40拷贝/μl,线性范围均为4.00×101~4.00×107拷贝/μl,相关系数均为1.000;扩增效率分别为flTF 91.15%,asTF 90.53%,批间变异系数分别为flTF 3.04%~9.31%,asTF 3.01%~9.64%。结论成功建立了检测人flTF和asTF的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高。

摘要：目的建立实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法。方法采用自行设计的检测协同刺激分子B7-H4及内参照基因GAPDH的引物及TaqMan探针，经优化反应体系及反应条件后，检测B7-H4及GAPDH的基因表达。将B7-H4和内参照基因GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确并纯化后分别与pMDl9-T载体连接，克隆构建含B7-H4及GAPDH基因片段的重组质粒，作为实时荧光定量PCR检测B7-H4及GAPDH基因表达的标准品。将重组质粒标准品进行定量及梯度稀释，建立标准曲线。结果PCR扩增产物分别经测序证实为B7-H4及GAPDH基因的特异性片段。该法检测B7-H4基因表达的灵敏度为527copies／ml，线性范围为5．27X×10^2～5．27×10^7copies／ml，标准曲线方程为：Y=-3．1395X＋41．805，直线回归相关系数r=0．995，批间变异系数范围为2．39％～3．59％，扩增效率108．2％。该法检测GAPDH基因表达的灵敏度为386copies／ml，线性范围为3．86×10^2～3．86×10^7 copies／ml，标准曲线方程为：Y=-3．2436X＋41．083，直线回归相关系数r=0．999，批间变异系数范围为2．26％～3．86％，扩增效率103．4％。结论成功构建实时荧光定量PCR检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

摘要：目的建立一种低成本、高效率、操作简便的单核苷酸多态性(SNP)检测技术。方法采用自行设计的"ShineRoar 探针",结合融解曲线技术检测目的基因 SNP。并根据其工作原理分别对肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)和载脂蛋白 M(apoM)的基因多态性进行检测;同时用 DNA 测序技术鉴定 ShineRoar 探针技术的准确性。结果融解曲线分析结果显示,某一基因的野生型及突变型纯合子分别在2个不同的融解温度出现融解谷。TNFRⅡ基因第6外显子196位突变(ATG→AGG)所产生的 T 和 G 等位基因的融解温度分别为(52.84±0.75)℃和(58.38±0.61)℃;apoM T-778C 突变所产生的 T 和 C 等位基因的融解温度分别为(42.55±0.73)℃和(49.19±0.57)℃。一致性 Kappa 检验显示 ShineRoar 探针技术与 DNA 测序技术的 SNP 检测结果一致(Kappa=1,P=0.000)。结论ShineRoar 探针技术简单、快速、准确,适用于大批量基因分型的研究。